细胞培养技术 - 上海交通大学医学院精品课程.docVIP

第二章 细胞生物学技术 细胞生物学的发展是与实验技术的进步密切相关的，细胞生物学的每一个重大进展都是由于引入了新的研究技术的结果。光学显微镜的发明开创了细胞学，电子显微镜的出现使人们对细胞结结构的认识深入到超微结构水平。细胞化学和分析细胞学技术可对细胞的各种成分进行定位和定量的分析，有利于细胞结构与功能的研究。细胞培养技术可将细胞在体外环境中生长，在体外研究细胞的结构、功能和生命活动规律，而细胞工程技术则可人为地将细胞进行改造，以获得具有特定生物学特性的细胞。近年来，分子生物学技术的广泛应用，更有力地推动了细胞生物学的发展。细胞生物学技术种类很多，包括物理技术、化学技术和实验生物学技术等，本章仅对主要的细胞生物学技术作简略的介绍，对于在细胞生物学研究中广泛应用的分子生物学技术，由于篇幅有限，本书不作介绍了。 第一节 显微镜技术 显微镜技术是细胞学和细胞生物学得以建立和发展的重要工具，包括光学显微镜（light microscope）、电子显微镜(electron microscope )和扫描探针显微镜(scanning probe microscope)三个层次的显微镜和相应的技术。在光学显微镜下看到的细胞结构称为细胞显微结构（microscopic structure），由于受到分辨率的限制，光学显微镜不能分辨直径小于0.2μm的结构，如生物膜、细胞骨架和一些细胞器等。电子显微镜下则可以观察到这些光学显微镜下看不到的结构，称为细胞亚显微结构（submicroscopic structure）。随着电子显微镜分辨率的不断提高，再结合一些其他技术如扫描探针显微镜和X光衍射等，己使人们对细胞结构的认识达到分子水平。一般把细胞从亚显微水平到分子水平的结构统称为细胞超微结构（ultrastructure）。 图2-1显示了不同分辨率时所看到的拇指表皮结构，从大体、显微、亚显微、一直到分子、原子水平。 参照前书图参照前书图2-1 图2-1 细胞与原子比例图 （引自Alberts等，2002） 参照前书图2-1 显微镜与分辨率 人类最初只是用肉眼直接观察周围世界，可是人眼观察事物的能力是有限的，一般情况下在25cm的明视距离内，只能分辨相距0.1～0.2mm的两个物体，如果小于这一距离，人的眼睛就不能分辨。17世纪英国人Hooke和荷兰人 Leeuwenhoek分别利用原始的光学显微镜发现了机体的细胞以及许多微生物，观察到了它们的微细结构，使生物学进入了光学显微镜时代，开创了组织细胞学的微观世界研究。但是不管多么完善的光学显微镜，它的分辨率极限为0.2μm，也就是说不能分辨出距离小于0.2μm的两个点。20世纪30年代，德国的Ruska发明了电子显微镜，突破了光镜的局限，其分辨率可达2nm左右，使人们对于细胞结构认识逐步深入到超微观世界。20世纪80年代IBM苏黎世实验室的Binning等人发明了扫描隧道显微镜，分辨率达0.2nm 左右，可直接观察DNA、RNA等生物大分子及生物膜等结构。 分辨率（resolution）是指区分开两个质点间的最小距离。对于任何显微镜来说, 分辨率都是最重要的性能参数。 光学显微镜的分辨率与光波波长，物镜数值孔径有关，可用Abbe公式表示： 0.61λ d = n × sin( d为分辨率，ｎ为物镜与物体间介质折射率,空气为1，油为1.5，θ为光束进入物镜的半角，sinθ小于１(以极值1代入公式)。 代入公式： d = 0.61×0.5μm／1.5＝0.2μm 因此在光学显微镜中，λ越短，分辨率越高；n和θ越大，分辨率也越高。n × sinθ简称N.A，即表示数值孔径，物镜上一般都标有 N.A值，N.A值越大，分辨率越高。 从上述计算中我们可以看出，光学显微镜分辨率受到光波波长的限制，大约等于所用光源的半波长。这是由于光波具有衍射现象，当光波波长大于物体二倍时，光波能绕过物体前进，就像没有遇到物体一样，所以在光镜下看不清直径小于波长一半的物体。当物体直径小于200nm（0.2μm）就分辨不清。 电子显微镜采用波长短的电子射线作为照明源，电子射线的波长约为可见光波长的十万分之一，约等于0.0053nm，但由于电子透镜相差的存在，限制了电镜的分辨率，使之不能达到如此高的程度。目前电镜的极限分辨率为0.2nm左右，比光学显微镜极限分辨率提高了约1000倍，比人眼分辨率提高了100万倍左右。 扫描探针显微镜的制作原理与光镜和电镜完全不同，如扫描隧道显微镜是利用量子力学