酸性磷酸酯酶的提取实验报告.docVIP

酸性磷酸酯酶的提取实验报告 酸性磷酸酯酶基础实验 实验一 酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定 [原理] 酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。 酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。它能专一性水解磷酸单酯键。本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。 利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即测定单位时间内405nm处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。 酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。 要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应 时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制 作而求出酶的初速度时间范围。本实验进程曲线是在酶反应 的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶 反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程 曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速 度。随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度 下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。 求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研 究中的组成部分和必要前提。 图 酶反应进程曲线 [试剂和器材] 1、试剂： （1）酸性磷酸酯酶原酶液 取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置冰箱6小时以上。将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3 000r/min离心15min，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽茎克数相等，以3 000r/min离心30min，所得的上清液即为原酶液，置冰箱待用。 （2）酸性磷酸酯酶液 取原酶液，用0.05mol/L pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11 号管吸光度 A405在0.6—0.7之间。 （3）1.2 mmol/L对-硝基苯磷酸酯（NPP） 精确称取NPP 0.4454g，加缓冲液定容至1000 mL。 （4）0.3 mol/L NaOH。 2、器材： （1）恒温水浴槽 （2）可见光分光光度计 （3）试管、刻度吸管 [方法和步骤] 取试管12支，按下表编号，0号为空白。各管加入1.0mL 1.2 mmol/L NPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7 mL，在酶反应前底物与酶都放入35℃恒温水浴槽中预热2分钟。然后向1～11号管内各加入1.0 mL 预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3、5、7、10、12、15、20、25、30、40、50分钟进行反应。待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0 mL 0.3 mol/L NaOH终止反应。冷却后以0号管作空白，在分光光度计上测定 405 * 0号管加入1.0mL NPP后保温25分钟，然后加入3 mL 0.3 mol/L NaOH，再加入1.0 mL酶液。 [数据处理] 以反应时间为横坐标，A405为纵座标绘制进程曲线，由进程曲线求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。 实验二 pH对酶活力的影响——最适pH的测定 [原理] pH对酶活力的影响极为显著。酶表现其最高活性时所处的pH即酶的最适pH，因为通常各种酶只在一定pH范围内才表现它的活力；一种酶在不同pH条件下所表现出来的活性不同。 pH之所以对酶活性有很大影响，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基团的解离状态。在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态，最适于酶与底物的结合；而高于或低于最适pH时，酶活性部位基团解离状态不利于酶与底物的结合，酶活力也相应降低。pH也可影响底物的解离及反应系统中其它组分的解离。缓冲系统的离子性质和离子强度，也可能对酶反应产生影响。另外，pH除了对酶活性有很大影响外，对酶的稳定性也有很大影响。过高过低的pH会改变酶的活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的结构使其变性失活。 本实验测定pH对酸性磷酸酯酶活性的影响并测定最适pH。 [试剂和器材] 1、试剂 （1）酸性磷酸酯酶原酶液 （2）酸性磷酸酯酶酶液： 原酶液用水稀释10倍左右，使pH-酶活力曲线中第六管O.D405在0.6-0.7之间。 （3）2.4mmol/L NPP水溶液 精确称取NPP 0.