RT-PCR技术简介-Gene.pptVIP

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2017-05-06 发布于湖北
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RT-PCR技术简介-Gene

RT-PCR实验方法简介;RT-PCR定义：;RT-PCR流程简介;一、抽提RNA： ;2、材料的准备组织及细胞最好为新鲜的，或者在－70℃条件下保存半年以下；尽量避免材料的冻融。;3、确认RNA的质量检测RNA溶液的吸光度： OD260/OD280=1.8－2.0 RNA的电泳图谱： 28S和18S条带明亮、清晰、指条带边缘清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上。 ;二、反转录：;三、PCR： ;2、目的基因 PCR 典型的引物18到24个核苷长，引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。 ;RT-PCR实例：;取反转录好的cDNA总量的1/10（10ul反转录体积则取1ul），稀释10倍（稀释至10ul），取1/10（1ul）为模板，用ACTIN引物、普通PCR体系、20－25个循环、以基因组DNA为对照（因为引物跨内含子，所以基因组DNA扩增出的条带大小与cDNA扩增出的条带大小不同，以去除残留的基因组DNA的影响）做PCR；取等量??物电泳，根据电泳条带的亮度调整模板量（如m1的亮度为Ws的2倍，则下次PCR时m1的模板为0.5ul），直到电泳亮度基本一致，可认为此时所取的不同体积的野生型Ws及突变体m1、m2模板里RNA的含量基本相同。以G1基因引物，按调好的模板体积做PCR，电泳。根据电泳条带的亮度比较野生型Ws及突变体m1、m2中G1基因的表达差异。 ; 谢谢！北京基莱生物科技研究中心 2006年12月制作