基因测序技术的发展.PDFVIP

2015-05-27 1 高通量基因测序技术的临床应用 李金明 国家卫生计生委临床检验中心 山东PCR培训班 2015.05.17.烟台 临床分子诊断技术发展历程：几个里程碑 1953年:DNA双股螺旋的发现 1963年:放射免疫测定技术 1972~1977年:重组DNA技术、核酸测序方法 1983年:PCR测定技术 1991-1993年:实时荧光PCR技术和芯片技术 2003年：人类基因组计划基本完成。后基因组的 功能基因组研究，药物基因组学 2007年--新一代高通量测序技术 基因测序技术的发展 1953年：DNA双股螺旋的发现（英国剑桥大学James Watson 和Francis Crick ） 1965年：酵母tRNA测序（美国Comell大学Rober Holley，小片段重叠法） 1971年：λ噬菌体两个粘性末端的完整序列（吴瑞博士，华裔分子生物学专家， 引物延伸测序） 1975年：加减法 DNA测序（英国剑桥大学Fred ） 1977年：Sanger测序（英国剑桥大学Fred Sanger）和Maxam-Gillbert DNA化学 降解法测序(美国哈佛Alan Maxam Walter Gilbert） 1996年：焦磷酸测序（瑞典皇家技术研究所Ronaghi M等） 2005年:Genome Sequencer20新一代测序仪(大规模并行焦磷酸合成测序法，454 life Science公司的创始人Jonathan Rothberg) 2007年:454、Solexa公司和Agencourt（SoliD测序仪）公司分别被 Roche、illumina和ABI公司收购。新一代测序技术（next-generation sequencing）2007年被Nature Methods评为生物领域影响力最大的技术 诊断医学 70%以上信息 来自实验室 诊断 监测 预后预测 分子诊断是整个 检验医学领域内 发展最快、最有 活力的，在疾病 的诊断和治疗中 往往有决定性作 用！ 分子诊断对 检验医学的 划时代意义！ 个体化医疗 （personalized medicine) 精准医疗 （precision medicine） 移动医疗 数字医疗 新一代高通量测序技术 公司名称 技术原理 技术开发者 商业模式 Apply Biosystem s(ABI) 基于磁珠的大规模并行克 隆连接DNA测序法 美国Agencourt私人基因组学公司（APG） 上市公司：销售设备和试 剂获取利润 Illumina 合成测序法 英国Solexa公司首席科学家David Bentley 上市公司：销售设备和试 剂获取利润 Roche 大规模并行焦磷酸合成测 序法 美国454 Life Sciences公司的创始人Jonat han Rothberg 上市公司：销售设备和试 剂获取利润，该产品已经 于2013年停产。 Helicos 大规模并行单分子合成测 序法 美国斯坦福大学生物工程学家Stephen Q uake 上市公司：2007年5月首 次公开募股（IPO）（P.S. 由于该平台准确率太低等 原因，该公司已于2012年 宣告破产） Complete Geno mics DNA纳米阵列与组合探 针锚定连接测序法 美国Complete Genomics公司首席科学家r adoje drmanac 私人公司：投资额为4650 万美元，该公司于2013年 被华大基因收购。 Illumina测序原理 illumina的Solexa 和HiSeq 两大平台为目前全球装机量最大 的二代测序平台，两大平台的核心原理均为边合成边测序 ，主要有4 个步骤： 1. DNA 文库构建：利用超声波将待测DNA 链碎片化为200- 500 碱基长的片段，并在片段两头加上接头引物。 2. Flowcell 吸附：文库构建好后，将文库DNA 通过flowcell 的表面槽道，槽道里有很多接头，可与DNA 碎片两端的接 头相互配对，因此DNA 碎片会被吸附在flowcell 的表面。 3. 桥式PCR 扩增与变性：PCR 的目的在于将碱基信号强度 放大，以达到测序需要的信号要求。桥式PCR 以槽道上的 接头为模板进行扩增，最终每个DNA 片段都在各自的位置 上集中成束，每一束含有多个DNA 模板片段的拷贝。 4. 边合成边测序：反应体系中包含DNA 聚合酶，接头引物 和带有特异荧光标记的4 种dNTP，这些dNTP3 端经过化学 保护，每次只能添加一个dNTP。随后洗脱反应，加入激发 荧光所需的试剂并用激光进行激发，采样荧光信号分析后 识别碱基，再加入化学试剂淬灭荧光信号并除去dNTP3 端 的保护，进行下一轮反应。 Illumina 这种一次只添加一个dNTP