琼脂糖凝胶电泳技术教程.pptVIP

琼脂糖凝胶电泳技术;一、实验目的 学习与掌握DNA电泳的技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量以及分子量，及分离不同大小DNA片段。; 三、实验原理; 琼脂糖是一种线性多糖聚合物，当其加热到沸点后再冷却凝固就形成良好的电泳介质，其孔径决定于其浓度。电泳介质中的孔径对电泳迁移中的带电分子产生一种阻力，阻力的大小取决于带电分子的大小及其物理性状。 ; 在生理条件下，核苷酸的磷酸基团是带负电荷的，所以DNA分子是多聚阴离子，在电场中向正极迁移。 DNA分子带电量与其大小成正比的。 在一定电场强度下，若无任何介质阻碍迁移，则大DNA分子比小DNA分子跑得快。但在实际电泳中，由于使用了琼脂糖分子筛介质，对大分子DNA产生了较强的阻力，因此大分子DNA尽管有较高的带电量，仍难以快速前进；小分子DNA由于能够穿越介质网孔，其带电量尽管相对较小，但仍能快速迁移到正极。因此，不同的DNA分子在琼脂糖凝胶中产生了不同的迁移距离，这种迁移距离的差异使得不同大小DNA得以分离。 核酸迁移率的影响因素：;影响核酸电泳的因素 1）核酸的性质 核酸的电荷量、分子大小、分子空间构象决定了不同核酸分子具有不同的迁移率。 线性双链DNA分子，分子量的常用对数与泳动率呈反比关系；而分子的空间构象影响影响泳动速率，如分子量相同的质粒DNA的迁移速率则是：闭环型线性单链开环型。 其他结构如：(A)单链RNA或单链DNA的分子内局部配对； (B) 与 蛋白质结合的DNA复合体 2）凝胶孔径大小 琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel， PAG）是核酸凝胶电泳常使用的支持材料，通过两种支持介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小，能分离不同分子量的核酸片段。;;不同（空间）类型核酸的凝胶电泳： 单链RNA或单链DNA——变性胶电泳：在缓冲液和凝胶中加入尿素或甲醛等核酸变性剂，使分子内配对结构打开，使其带电量和分子形状无关，仅与分子大小有关。 质粒（具有高级结构的DNA）——一般的琼脂凝胶电泳；但由于结构的不同可能会出现不同的条带。 比较大的DNA分子——脉冲式电泳 与蛋白质结合的DNA复合体——凝胶电泳阻滞分析（electro-mobility shift assay , EMSA）。; 3）电场强度和电场方向 低电压时，线状DNA片段的电泳迁移率与所加的电压成正比，通常凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm凝胶。 对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5~1.0V/cm电泳过夜，以取得较好的分辨力和整齐的带型。 可以通过脉冲电场凝胶电泳分离极大片段的DNA。 4）电泳环境 缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率。 传统最常用的是TAE，但其缓冲能力很低，长时间电泳需要正、负电极贮液槽之间进行缓冲液循环，并经常更新TAE。; 缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比，电泳的最适离子强度一般在0.02~0.2之间。在高速离子强度下（如误加10×电泳缓冲液），溶液导电性极高并明显产热，可能引起凝胶熔解及DNA变性。 缓冲液的pH值影响DNA迁移率，溶液的pH值远离样品等电点时，样品荷电量越多，泳动越快，核酸电泳液常用偏碱性或中性条件，使核酸带负电荷，向正极泳动。 在进行电泳时，荧光染料EB可插入到碱基中，从而增加线状和开环DNA的长度，使其刚性更强，并会使线??DNA的迁移率降15%，另外温度和碱基堆积也会影响DNA的迁移率。 ;;;1）取50×TAE缓冲液母液适量（多少？）加蒸馏水配成1×TAE电泳缓冲液50mL； 2）称量琼脂糖（多少克？），转入三角瓶内，加TAE缓冲液用微波炉熔化；(1%) 3）装好凝胶板并插入梳子，放在水平台上，注意梳子底端应距凝胶板面有0.5~1mm的间隔； 4）待胶冷却到50~60 ℃（手能触摸的温度）倒入封好的凝胶槽，厚度约3~5mm，注意检查是否有气泡产生，如有可用吸管小心吸出气泡。 ;;实 验 过 程 简 图;电泳电极和电泳槽及胶孔的位置;;;;;;;;;;;作 业 ;谢谢！请大家开始分组实验