2T淋巴细胞转化实验选读.pptVIP

实验八 T淋巴细胞转化试验;T淋巴细胞;;实验目的 实验原理 试剂与器材 操作步骤 结果判断 注意事项 实验讨论;一、形态学计数法;实验目的; T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应，如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。 ;1. RPMIl640 培养液 。包含： 小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素 100ug/m1，用无菌的3% NaHCO3 调 pH 至 7.2～7.4。 2. 植物血凝素（PHA）。用含10%小牛血清的RPMI 培养液稀释至500～1000?g/ml。 ;3. 姬姆萨染液。 4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 5．器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。;5%CO2 37℃ 72h; 1．取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内，同时加入PHA(500?g/ml )0.1 ml，对照??内不加PHA。混匀后置37?C、5%CO2培养箱内孵育72h，期间每天旋转摇匀一次。 2．培养结束后，弃去上清，混匀细胞，加入离心管中，1500rpm 离心10min。; 3．弃上清，吸取白细胞层制片，自然干燥。 4．甲醇固定1～2min后，姬姆萨染色15～20min，水洗，干燥。 5．油镜下计数200个淋巴细胞，观察淋巴细胞的形态变化，计算淋巴细胞转化率。;;淋巴细胞标志及功能检测 龚道科 2002.4; 未转化和转化淋巴细胞的形态特征;四、结果观察;淋巴细胞标志及功能检测 龚道科 2002.4;;;淋巴细胞标志及功能检测 龚道科 2002.4;;结果判断;;;;;; 1 ．培养基成分对转化率影响较大，注意其有效期。 　2 ．小牛血清用前需灭活。 　3 ．培养时要保证有足够的气体，保证无菌。 　4 ． PHA 剂量过大对细胞有毒性，PHA 转化反应剂量一般 10m1，培养瓶内液体总量不要超过 2m1 ，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验前应先测定。 ;二、MTT比色法;实验目的;一、原理;1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。 3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 4. 器材 超净台、96孔细胞培养板、 CO2培养箱、高压灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶联免疫检测仪等。 ;5%CO2 37℃ 68h; 1.先采用密度梯度离心法分离外周血单个核细 胞，并用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液调 整细胞浓度至1?106/ ml。 2．将细胞悬液加入96孔培养板中，100?l/孔， 每个样品三个复孔，并设相应对照孔。实验孔 加含50?g/ml的PHA(终浓度5?g/ml) 100?l， 对照孔加不含PHA的1640培养液100?l， 3．混匀后置37?C、5% CO2培养箱内培养68h。;4．将培养板1500 rpm离心10min，吸弃上清 液，每孔加MTT20?l，混匀，继续培养4h 后，每孔加100?l盐酸异丙醇，低速振荡10 min。 5．充分溶解后，采用酶联免疫检测仪双波长 570nm/630nm测定各孔A值，测定值为A570nm 减去A630nm的最终结果。 ;结果判断;1.实验过程注意无菌操作。由于本实验需要培养3 天才能观察结果。因此，在操作时应避免细菌 污染导致实验的失败。 2．淋巴细胞要新鲜制备, 一般在采血后2h内进行 实验。操作时动作要轻柔、迅速，以免细胞损 伤而影响实验结果。;3．加入MTT比色法盐酸异丙醇后要在30 min内进 行测定，若规定时间内来不及测定，可将未加 盐酸异丙醇的培养板置4?C保存。测定前取 出，室温静置10min后再加盐酸异丙醇。;1.试讨论MTT比色法淋巴细胞转化试验的优缺点？ 2. MTT比色法容易因细菌污染导致实验失败，应采取哪些措施可减少实验误差，使结果可信？;三、3H-TdR掺入法;实验目的;一、原理;1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。 3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 4. 3H-TdR工作液 以生理盐水稀释成100?ci/ml，于4℃ 保存备用。 5．闪烁液 避光保存。 6．器材 96孔细胞培养板、CO2培养箱、49型玻璃纤维滤 纸、多头细胞收集器、β-液体闪烁计数仪、闪烁测量 杯。;5%CO2 37℃ 56