Promocell原代细胞培养探析.ppt

经验分享——原代细胞和干细胞培养中可能出现的问题;Cytokines Antibodies ELISAs Cell Assays Transfection Reagents ;1990年开始科学家指导科学家;;微生物污染 (I);真菌污染 培养基变黄（pH值改变） 生长相对缓慢 来源：气流 显微镜下： 菌丝体—主要是植物式的生长模式 分枝菌丝—菌丝体，孢子生产能力强 不要打开培养容器，?直接丢弃！;酵母菌污染 培养基呈云雾状 椭圆形，酵母细胞芽接，成链 大约3-5μm 来源：气流 可以用抗真菌药剂清除（如两性霉素B和制霉菌素）;支原体污染 首次发现于1898年，被定义为病毒 是已知的能自我复制的最小原核生物 直径为0.2-0.8μm?能够通过孔径为0.45μm的纤维素和聚乙烯醇过滤器（由于其变形的能力，甚至能够穿过0.22μm宽的孔径！） 缺乏细胞壁肽聚糖?耐青霉素 一般在培养中无明显的表象（肉眼不可见，显微镜下也不可见 一般发生在胞外，只有极少数几率发生在胞内 ;微生物污染 (IV);支原体污染后的表现和肉眼可见特征;对生长速度的不利影响 支原体能够与细胞竞争营养物质，并分泌有害的代谢产物，从而对细胞增殖能有50%的抑制作用（有这篇文献为证McGarrity et al., 1984） 葡萄糖快速降低，形成酸?pH值转变 精氨酸耗尽?抑制蛋白质的生物合成，细胞分裂和细胞生长 引起染色体畸变和多种易位（McGarrity et al., 1978） 基因芯片和基因表达谱产生显著的变化 支原体能够占总蛋白的50%和纯化总DNA的15-30% 他们甚至能够基本上控制宿主细胞所有的代谢功能;对生长速度的不利影响 支原体能够与细胞竞争营养物质，并分泌有害的代谢产物，从而对细胞增殖能有50%的抑制作用（有这篇文献为证McGarrity et al., 1984） 葡萄糖快速降低，形成酸?pH值转变 精氨酸耗尽?抑制蛋白质的生物合成，细胞分裂和细胞生长 引起染色体畸变和多种易位（McGarrity et al., 1978） 基因芯片和基因表达谱产生显著的变化 支原体能够占总蛋白的50%和纯化总DNA的15-30% 他们甚至能够基本上控制宿主细胞所有的代谢功能 因此要进行支原体检测以便验证支原体的存在;支原体的检测;支原体的检测;被污染的细胞培养物或者病毒储液的处理;支原体清除的方法;污染来源;细胞培养中出现污染的其他原因;良好的细胞培养规范 (GCCP);实验中： 不要在敞开的瓶子或者培养皿上方操作 在超净工作区域里面或者靠近超净工作区域的动作不要太快 否则将会阻碍超净工作区域内的正常气流循环 在实验中不要触摸超净工作区域外的任何东西（特别是自己的脸和头发）以免污染乳胶手套 如果乳胶手套被污染了，那么在继续操作之前需要重新对其进行消毒 不要把没有用的仪器堆在通风罩里面从而阻断气流 将所有溢出或溅出的液体擦去 讲话，打喷嚏或者咳嗽请远离超净工作区域，以免干扰气流/引入污染;实验结束以后： 从超净工作台中取出仪器和材料之前，都需要进行消毒 消毒超净工作台的台面 根据生产厂商的说明书定期选用合适的消毒剂对超净工作台表面进行消毒 定期使用生产厂商的超净工作台的层流罩维护服务 （并记录紫外灯的“失效”情况），这一点非常重要 ;消极影响： 有毒性，抑制增殖 对几种细胞的分化有负面的影响（例如血液祖细胞） 会导致原代细胞的增值速率降低（抑制率高达40%）（参考文献：The prophylactic use of antibiotics in cell culture, Ingrid Kuhlmann 1996） 会影响基因/蛋白的表达 会导致耐药性;预防性地使用抗生素会使得操作人员忽视细胞培养中的无菌操作规范从而导致无菌条件的破坏 抗生素在37oC时只能维持短暂的稳定（耐热性能；Pen/Strep: 3天) 只有在完全确定需要时才使用抗生素： 从组织中分离原代细胞 非常珍贵和无法替代的细胞系 在诱导型的启动子系统中 可能的话：尽量在没有抗生素的情况下进行标准操作;细胞培养中的常规步骤;目标：保留尽可能多的健康有增殖能力的细胞能存活 然而：解冻的操作过程对细胞压力很大 冻存液中包含DMSO作为抗冻保护剂 液体的DMSO（在解冻过程中）对细胞是有毒的：DMSO的最终浓度不能超过1%（细胞在该种情况下能耐受16-24h） 因此必须： 在37oC的环境下尽快解冻细胞 在把细胞取出液氮罐之前，尽量准备好所有的东西 解冻后尽快稀释DMSO ;解冻细胞——步骤;解冻细胞——步骤;解冻细胞——步骤;解冻细胞——步骤;解冻细胞——步骤;解冻细胞——步骤;细胞培养工程师;CO2 培养箱;细胞培养工程师;更换培养基;用Melanocyte Growt