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实验3 氨基酸类物质的紫外光谱分析和定量测定 汪洋洋p一、实验目的 （1）掌握紫外–可见分光光度计的工作原理与基本操作。 （2）学习紫外–可见吸收光谱的绘制及定量测定方法。 （3）了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱的特点。 二、实验原理 紫外-可见分光光度法属于吸收光谱法，分子中的电子总是处在某一种运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。电子由于受到光、热、电等的激发，从一个能级转移到另一个能级，称为跃迁。当这些电子吸收了外来辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并纪录该物质在每一波长处的吸光度（A）,然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样得到的谱图??该物质的吸收光谱或吸收曲线。 当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度I0与透过光强度It之比的对数与该物质的浓度c及厚度b成正比。其数学表达式为： （一） 式（一）为Lambert-Beer定律，是分光光度法定量分析的基础，其中T为透光率(透射比）。 物质的吸收光谱反映了它在不同的光谱区域内吸收能力的分布情况，不同的物质，由于分子结构不同，吸收光谱也不同，可以从波形、波峰的强度、位置及其数目反映出来，因此，吸收光谱带有分子结构与组成的信息。 氨基酸类物质的一个重要光学性质是对光有吸收作用。20种氨基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区（220 nm）均有光吸收，在紫外区（近紫外区）（220 nm—300 nm）只有三种AA有光吸收能力，这三种氨基酸分别是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，因为它们的结构均含有含有苯环共轭双键系统。苯丙氨酸最大吸收波长在259 nm、酪氨酸在278 nm、色氨酸在279 nm，蛋白质一般都含有这三种氨基酸残基，所以其最大光吸收在大约280 nm波长处，因此能利用分光光度法很方便的测定蛋白质的含量。 本实验将对苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸三种氨基酸进行光谱测定及相关定量测定。 三、仪器和试剂 1 仪器 紫外-可见-近红外分光光度计（UV-3600或UV-2401）；分析天平； 0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL移液管若干；10 mL带塞比色管若干。 2 试剂 标准溶液(a): 2.0 g/L的苯丙氨酸溶液； 标准溶液(b)：0.4 g/L的酪氨酸溶液； 标准溶液(c)：0.4 g/L的酪氨酸溶液（所有溶液均用去离子水配制）；酪氨酸待测样。 四、实验步骤 （1）分别移取标准溶液(a)（2.0 g/L，1.0 mL）、标准溶液(b)（0.4 g/L，1 mL）和标准溶液(c)（0.4 g/L，0.4 mL）标准溶液于10 mL比色管中，用去离子水稀释、定容、摇匀，待用。 （2）分别移取0.00、0.5、1.0、1.5、2.0 mL标准溶液（b）于5个10 mL比色管中，并用去离子水稀释、定容，摇匀，待用。 （3）双击分光光度计图标“UVProbe”,出现软件界面，点左下角“连接”，系统开始自检，等系统自检结束。预热15-30分钟。待仪器稳定后方可使用。 （4）在光谱测量模式下，以去离子水为参比溶液，分别绘制步骤（1）中各溶液在200～350nm波长范围内的吸收光谱。并记录各标准溶液的λmax 。 （5）在定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤（2）中的各标准溶液在λmax处的吸光度。 （6）在步骤5同样条件下，测定未知样品溶液在λmax处的吸光度。 五、数据处理 （1）将苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸溶液的吸收光谱叠加在一个坐标系中，比较它们的吸收峰的变化，说说有什么不同，为什么？ 色氨酸的的吸收系数更大，如图：酪氨酸，色氨酸，色氨酸的共轭范围更广，所以紫外吸收更强烈。 （2）以上述步骤6测得的各标准酪氨酸溶液的吸光度为纵坐标，相应的浓度为横坐标绘制工作曲线，再根据未知溶液的吸光度，利用标准曲线求出待测样浓度。 样品 ID,类型,浓度,WL278.0,注释 un,Unknown,23.025,0.181, 即样品的浓度为23.025。吸光度为0.181。 六、思考题 （1）本实验是采用紫外吸收光谱中最大吸收波长进行测定的，是否可以在波长较短的吸收峰下进行定量测定，为什么？ 答：选择最大吸收波长测定是因为封顶平缓，波长的微小改变对吸光度影响不大，以减少误差。 （2）被测物浓度过大或过小对测量有何影响？应如何调整？调整的依据是什么？ 答：过大会超过检测器的检测范围，出现平顶峰，过小，信号太弱。最好是调整溶液浓度。?如果是定量分析，标准曲线不遵从