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基因工程-5-重组DNA构建与筛选
三重组DNA分子构建与筛选 ;一、粘末端DNA片段的连接;;二、平末端DNA片段的连接;（二）同聚物加尾法;（三）衔接物连接法;（四） DNA接头连接法 接头的一端是齐平的，而另一端是某种内切酶的粘性末端;（五） PCR引入酶切位点;防止载体自身环化的措施 1、碱性磷酸酶脱磷酸基法 2、双酶切法 3、过量法： 基因片段：载体（5:1 or 10:1) ;第三节 基因转移;一、重组DNA导入大肠杆菌 ;1、转化过程 E.coli ：感受态细胞＋重组DNA分子 加入LB扩增 涂布选择性平板 ;热激法（Heat Shock Method）;（三）电激法(electroperation) ;1.电转化流程;二、重组DNA导入植物细胞的方法 ;;（2）叶盘共培养法 ;2、活体接种 (inoculation in vivo) ;（1）基因枪法;;基因枪所用材料： （1）钨粉使用起来经济实惠，也可以得到较好的转化效果；但容易被氧化，颗粒易聚集，并且对植物细胞的毒害也比金粉大。;（2）微注射法（micro-injection） ;（2）DEAE-葡萄糖转染技术 ;（6）活体电穿孔技术 ;活体电穿孔法在基因治疗方面的应用;第四节 重组DNA分子的筛选;外源基因与载体连接后转化大肠杆菌可能的三种情况：;一、重组体的筛选;（一）遗传检测方法 原理： 根据载体DNA分子上的筛选标记赋予受体细胞在筛选平板 上表型的变化。如抗药性引起生长与不长；颜色变化等。 方法： ① 插入失活抗生素平板筛选法（pBR322系统） 由于外源DNA的插入引起抗药性失活——插入失活;插入失活-环丝氨酸筛选法;②放射免疫筛选法 1.放射免疫筛选过程 A、制备抗原：培养菌落 （噬菌斑） B、制备抗体：免疫动物 C、抗原抗体反应 D、检测：放射自显影 E、选出重组体;;2.放射免疫筛选法优点： ①可以选出无表型特征的克隆 3.放射免疫筛选法缺点： ①必须是表达载体 ②需要放射性物质——同位素：污染 昂贵 ;(三) 核酸杂交方法;二、核酸探针类型;非放射性标记原理;三、菌落原位杂交;菌落生长 转移到NC膜上 DNA释放和变性 固定 杂交 洗膜 放射自显影 查找阳性克隆;四、斑点杂交（Dot blot）;四、斑点杂交（Dot blot）;五、转译筛选法 ;1、杂交阻断转译 ;
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