大肠杆菌表达重组人粒细胞—集落刺激因子包涵体的复性与纯化.pptVIP

大肠杆菌表达重组人粒细胞-集落刺激因子包涵体的复性与纯化;基因工程操作：基因扩增、表达；原核细胞；包涵体的形成与特点。 重组蛋白分离纯化：细胞收集 、破碎；包涵体的溶解； 蛋白质变性、复性：稀释法、透析法、蛋白质折叠液相色谱法； 蛋白质构象的表征：包涵体构象变化、圆二色谱法;仪器分析：色谱技术 –液相色谱技术…… 仪器分析：光谱技术-荧光光谱、核磁共振 …… 化学生物学导论：蛋白质、酶…… 蛋白质与酶化学：重组DNA技术…… 蛋白质纯化与表征：液相色谱法、蛋白质构象表征….. 有机化学：荧光探针;背景知识;实例：粒细胞白血病;人粒细胞-集落刺激因子对造血系统的调控作用; 名称;复性与纯化方法;西北大学化学与材料科学学院;一、实验目的;基因工程技术是指人们按照自己的愿望，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物物种，使现有物种出现人类需要的性状的技术; 以大肠杆菌克隆表达系统为基础的原核基因工程技术，使得人们可以在大肠杆菌中高效表达出几乎任何一种有理论和应用价值的蛋白。;大肠杆菌中高效表达的蛋白，常常以不可溶解包涵体存在； 包涵体是由错误折叠的多肽形成的致密、非晶体性的蛋白沉淀物，其一级结构（即氨基酸序列）是正确的，立体结构是错误，所以没有生物活性； 包涵体能够溶解于强的变性剂，如8 mol/L脲或6-7mol/L盐酸胍溶液中。 ;直接稀释法（Direct dilution），包括透析法和超滤法 液相色谱复性法（Chromatographic methods for protein refolding） 人工配基辅助的蛋白复性（Artificial molecular chaperone assisted protein refolding) ;液相色谱复性蛋白的过程;西北大学化学与材料科学学院;;天数;四、实验步骤与方法;四、实验步骤与方法-流动相组成;1、普通SEC法对hG-CSF复性与纯化;2、脲梯度SEC复性rhG-CSF;优化的条件下复性与纯化;rhG-CSF的SEC复性与同时纯化产物色谱图； 复性与纯化产物SDS分析图； 紫外分光光度法测定复性与纯化产物含量结果； 荧光光谱表征复性前后的构象；;SEC复性rhG-CSF的色谱图;;进样量 (?L);五、实验结果与讨论-蛋白的构象表征;使用超声波时应控制强度在一定的限度，即刚好低于???液产生泡沫的水平。产生泡沫会导致蛋白质变性。 样品加上上样缓冲液煮沸后，一定要进行离心，以除去颗粒物质。 电泳上样时要小心，不要污染旁边的泳道。 在复性蛋白时，要注意一定要缓慢加入包涵体复性缓冲液，以防止变化太快造成蛋白质聚集析出。 ;六、实验延伸-二硫键对接 ;最具有代表性的是多维能量景观学说（multidimensional energy landscape)和折叠漏斗(folding funnel)模型。这两种机制都可以很好地预测蛋白的复性路径。;实时核磁共振光谱可用来跟踪蛋白的折叠反应;思考题;参考文献 ;罗丹明基“OFF-ON”型荧光探针对金属离子的识别特性及其生物学应用（选修）