DNA印迹杂交。.ppt

核酸分子杂交技术;一、 分子杂交的基本方法;核酸的分子杂交;二、核酸分子杂交的基本原理;Hybridization of Nucleic Acids; （一）DNA变性与复性;2、变性的方法： （1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。 （2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 （3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。 ; （二） 复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。 具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。;探针; 标记物种类 ;（三）标记方法 体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使 核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中， 3H-尿苷可掺入到RNA中 ;;三、Southern blotting DNA印迹与杂交;;Southern bloting的主要步骤;（a）; 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都必须通过毛细管或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，因此，核酸杂交也被称为“DNA印迹杂交”。; 杂 交 模 式 图; bp —1534 — 994 — 695 — 515 — 377 — 237;在 凝胶中DNA的变性为碱变性 ;4.1 固相支持物的选择 （1）理想的固相支持物应具备的特性 ①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 ?非特异吸附少;4.2 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜 ②尼龙膜 ③化学活化膜;4.3 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法;;（2）电转法;（3）真空转移法;; Southern杂交分为三步 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 预杂交液为不含DNA探针的杂交液 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需为单链，再杂交 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA ;最后为杂交结果的检测;五、 其它分子杂交方法;;Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳 中不变性 2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理，Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理 3、靶核酸为RNA;核酸技术的应用;核酸印迹技术的应用;以上