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CRISPR流程 设计靶组分并使用CRISPR设计工具 1d 输入目标基因组DNA序列 我们提供在线CRISPR设计工具() 可以输入序列（例如，来自目的区域的一个1KB基因片段），识别和排列合适的靶位点，计算预测每个指定靶标的off-target位点。或者，可以通过确认任何5’-NGG直接上游的20-bp序列手动选择引导序列。 用在线工具确定，订购需要的oligos和引物。如果手动确定分裂位点，oligos或引物应该按照fig4b.c设计。 设计ssODN模板（任选） 1h 设计和订购定做的ssODN。购买直接来自IDT或首选供应商的正义或反义ssODN的其中一个。我们推荐手动设计每侧至少40nt的同源臂，90nt可以得到最佳HDR效率。PAGE纯化ssODN不是必要的。 重新溶解和稀释ssODN ultramers到终浓度10uM。不要使正义和反义ssODNs结合或退火。储存在-20°。 准备sgRNA表达结构 为了构建sgRNA表达结构，使用PCR表达cassette（选项A）或以质粒为基础的步??（选项B） 通过PCR扩增构建sgRNA表达结构 2h （i）准备稀释的U6 PCR模板。 我们推荐使用pSpCas9（BB）或pSpCas9n（BB）（spl.2）作为PCR模板，但任何包含U6的质粒都可以使用。用ddH2O稀释模板到10ng/ul。注意，如果一个质粒或cassette已经包含一个U6驱动的sgRNA作为模板，PCR之后就要进行一个凝胶回收（gel extraction）（step 5A iv），用QIAquick 胶回收试剂盒，来确保产物只含有目的sgRNA并且没有从模板来的任何sgRNA。 （ii）准备稀释的PCR引物。 ddH2O稀释U6-Fwd和U6-Rev（均用CRISPR设计工具或手动设计，对每个sgRNA是特异的。step1）引物（table1）到终浓度为10uM：加10ul 100uM引物母液到90ul ddH2O。 （iii）U6-sgRNA PCR。以下反应for每个U6-Rev引物： 关键步骤：为了使扩增sgRNAs中的错误最小化，用高保真的聚合酶是很重要的。其他的高保真聚合酶，例如PfuUltra II（Aligent）或Kapa HiFi(Kapa Biosystems)，可以被用作替代。 （iv）用以下循环条件做PCR （v）反应完成后，把一个样品产物跑胶来证明扩增成功：2%（wt/vol）琼脂糖胶，有SYBR Safe dye的TBE buffer 。5ul PCR产物用来跑胶，15V/cm 30min。反应成功的话应该有一个单独的370bp产物，模板应该看不见。 ？troubleshooting （vi）纯化PCR产物，用QIAquick PCR纯化试剂盒。洗提DNA在35ul EB buffer（试剂盒中的）或H2O。 Pause point：纯化的PCR产物可以在-20°储存几个月 （B）sgRNA cloning进入pSpCas9（BB）质粒，与Cas9共表达 3d （i）准备sgRNA oligos插入。重悬每个设计的sgRNA的顶部和底部strands（step1）到终浓度为100uM。准备以下体系使sgRNA oligos磷酸化和退火（顶部和底部组分strands）： （ii）使oligos在thermocycler 中磷酸化和退火，用以下参数：37° 30min;95° 5min;用5°/min降至25°。 （iii）1:200稀释磷酸化的和退火的oligos：加1ul oligo到199ul室温ddH2O。 （iv）sgRNA oligos cloning到pSpCas9(BB)。每个sgRNA进行以下反应。我们推荐用一个未插入的，pSpCas9(BB)-作为一个阴性对照。注意：如果在之后的应用中用Cas9 D10A切口酶突变体，用pSpCas9n(BB)代替pSpCas9(BB)。或者，如果需要基于荧光的筛查或选择，用pSpCas9(BB)-2A-GFP, pSpCas9(BB)-2A-Puro, pSpCas9n(BB)-2A-GF或 pSpCas9n(BB)-2A-Puro代替。以下步骤使用pSpCas9(BB）为例： （v）孵育ligation反应 共1h (iv)用PlasmidSafe核酸外切酶处理ligation反应，消化残留的线性DNA。这个步骤可选择但高度推荐。 （vii）孵育PlasmidSafe反应：37° 30min,70° 30min Pause point：此处理后，反应可以储存在-20°至少1周 （viii）转化。转化PlasmidSafe处理的质粒到感受态E.coli菌株，根据细胞提供的说明。我们推荐Stbl3菌株做快速转化。