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基因工程及其医学应用 Genetic Recombination and Genetic Engineering 基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA 分子。 重组DNA技术发展史 pSC101 EcoRI Boyer 和Cohen的实验 Boyer 和Cohen的实验 pR6-5 大肠杆菌 pSC101 pR6-5 抗四环素 抗卡那霉素 EcoRI 抗卡那霉素基因 DNA连接酶 重组DNA分子 培养平皿 大肠杆菌 克隆 来自同一始祖的相同拷贝的集合。 （一）DNA克隆 分子克隆 细胞克隆 动物克隆 DNA克隆 应用酶学方法，在体外将某些遗传物质的DNA与载体DNA结合，形成一种具有自我复制能力的DNA分子，转化至宿主细胞中，进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。 DNA克隆 目的基因 载体 复制子 宿主细胞 扩增 扩增 提取DNA分子 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等 目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。 （二）基因工程 SS基因 基因载体 重组体 分 切 接 转 筛 表 SS 按照人的愿望设计和建造非天然的基因表达体系。 第 二 节自然界的基因重组 DNA Recombination 一、接合作用 当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。 可接合质粒如 F 因子(F factor) 质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 二、转化作用 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。 例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。 三、转导作用 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。 λ噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway) 例 目 录 目 录 发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。 （一）同源重组 四、基因重组 （二）位点特异重组 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。 例 λ噬菌体DNA的整合 λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 （三）转座重组 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。 第 三 节 基因工程的核心技术 一、重要的技术工具 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 重组DNA技术中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3´末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 限制性核酸内切酶 定义 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 + Bam HⅠ 作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。 分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） 第一个字母取