分子生物学第一次讨论人类基因组DNA提取、限制性核酸内切酶切割的原理方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用.pptVIP

;; 人类基因组DNA提取可以从外周血，肝或脾组织取材，也可以无创伤的采集材料，如用口腔上皮脱落细胞，发根细胞。提取方法有经典酚醇法、盐析法、煮沸法。 以下以酚醇法提取外周血白细胞DNA为例;原理;DNA和蛋白质的性质 DNA整体表现为酸性，带负电。是极性化合物，微溶于水，不溶于乙醇，苯酚，氯仿，乙醚等有机溶剂，形成沉淀。从而被分离提取出来。 蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀，从而被除去。;相关试剂及作用 细胞裂解液 :82.9g NH4CL， 10gKHCO3，0.37gEDTA·NA2, 灭菌双蒸水定容至1000mL EDTA·NA2是一种血液抗凝剂 低渗溶液使细胞膜涨破，白细胞释放细胞核，红细胞释???血红蛋白 细胞核裂解液(STE)：0.1 mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA 使核膜破裂，释放染色质 EDTA是一种血液抗凝剂，同时抑制核酸酶活性，防止DNA被水解。 ; RNase是RNA酶，能水解去除DNA中的RNA SDS（十二烷基硫酸钠）是一种去污剂，能导致蛋白质变性，成为易溶于水的复合物。从而破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来。 蛋白酶K是一种很强的蛋白水解酶，在SDS中稳定。水解各种蛋白质（包括糖蛋白和肽类，和脂类，胺类物质）。同时由于RNA酶和DNA酶是蛋白质，也可被水解，从而防止DNA被水解。 ;酚是蛋白质的变性剂，并将变性的蛋白质溶解其中。而DNA则溶解于水相。 氯仿也是蛋白质的变性剂，促进两相分离，并除去DNA溶液中的酚。 无水乙醇：DNA不溶于其中， 沉淀DNA 70%乙醇：溶解其他有机溶剂， 而DNA几乎不溶于其中， 洗涤DNA沉淀。洗涤完后， 乙醇易挥发。;注意事项 操作时要戴手套，因为苯酚是腐蚀剂，另外防止手上的核酸酶或细菌污染DNA样品。;方法;限制性核酸内切酶; 分类 根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子 I类酶在DNA分子上没有特异性的酶解片断 Ⅱ类酶在DNA分子上有特异性的酶解片断;原理;切割方法;;氢氧化铁胶体在直流电作用下移向阴极，这是大家熟悉的电泳实验现象。后来发展起来可以减少外界干扰的区带电泳技术，这是一种用固体作支持介质的电泳技术，待分离物质通过在支持介质中移动而得以分离成若干区带。如果用琼脂糖凝胶作支持介质，这种区带电泳技术则称为琼脂糖凝胶电泳。;在电场作用下，DNA和RNA之类生物大分子可在琼脂糖凝胶中运动。由于分子泳动速率与分子大小和分子构型有关，因而可将不同大小的分子，或分子大小相同但构型不同的分子分离开来。琼脂糖凝胶电泳技术在当代已经成为一种极其重要的分析手段，广泛应用于生物化学、分子生物学、医学、药学、食品、农业、卫生及环保等许多领域。;什么是琼脂糖凝胶 琼脂糖凝胶电泳技术使用琼脂糖凝胶作为固体介质。从海藻提取出的琼脂中可以分离出一种胶状多糖，称为琼脂糖。琼脂糖通常为自色粉末，有时稍带色。它的主要成分为交替连接的D-吡喃半乳糖和3，6-脱水-L-吡喃半乳糖基。 琼脂糖分子中含有很多羟基，羟基之间的氢键使琼脂糖分子聚集，成为形成凝胶的主要作用力。;琼脂糖形成凝胶的过程如图3所示。在加热条件下，琼脂糖溶于水，形成溶液。当该溶液的温度降至45℃左右时，多糖链(图3左部)通过链间的氢键形成双螺旋结构(图3中部)。双螺旋之间通过氢键相连成束，束间再通过氢键作用形成三维网络结构(图3右部)，即凝胶[3’6]。由于维系三维网状结构的作用力主要是氢键，因此能破坏氢键的因素都能破坏琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶三维网络结构中存在大量微孔，这就是DNA分子在凝胶中移动的通道。;在一定的电场强度下，相同构型的DNA分子，在凝胶中的迁移速率与分子量的对数值呈反比关系，因此可以将不同分子量的DNA分开。分子量相同时，不同构型DNA分子的迁移速率也不同，也可以分开。图展示了DNA的3种分子构型。;电泳是如何实现分离DNA的 电泳实验过程通常包含4个环节。将琼脂糖在水中加热到90℃以上使其溶解后，趁热倒入制胶板中，让它在室温下自然凝固，形成半固体状的无色透明凝胶片。这一步称为制胶。;制胶板中事前插有梳子，当凝胶形成后，移去梳子，胶片中就留下了小孔。将这样的凝胶片放人电泳槽(图7)，加入电泳液后，向小孔中加入待分离的DNA样品。 这一步称为点样，通 常的点样量只有几个 微升。接通电源，在 电场的作用下，DNA 分子在凝胶的孔隙中 向