1-印迹技术-3学时.ppt

* 此张幻灯片不用讲述。3个学时恰好。 1.加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使P二硫键还原，SDS使氢键、疏水键打开，并结合到P分子上，形成P-SDS，带上相同密度负电荷，形状为长椭圆形，短轴一定，长轴长度正比于P分子量。 2.当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： 1gMr =K―bmR 式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和K均为常数。 3.SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1 ? 1.4比例结合。 * TBST (Tris-Buffered Saline Tween-20) recipe TBS-T Buffer To prepare 3L of 10x concentration stock Tris: 180g NaCl: 240g KCl: 6g Mix the chemicals together in a 3L container, which already contains .5L MilliQ H2O. Use a stir bar to assist in solubility. Adjust the volume with MilliQ H2O to ~2.5 mL Adjust the pH to 8.0 Add 30mL of Tween (0.1%) to finalize the preparation. Make sure the volume is correct by pouring the contents into a graduated cylinder; be sure to adjust with MilliQ water accordingly. Tris: 0.005M, FW: 121.1 NaCl: 0.138M, FW: 58.44 KCl: 0.0027, FW: 74.56 （一）印迹技术（blotting）的原理 是指将各种生物大分子（蛋白质和核酸）从凝胶转移到一种固定基质（NC膜等）上并加以分析的技术。 印迹 凝胶 NC膜 （二）分子杂交的原理 分子杂交技术的特点 ——是利用DNA变性与复性这一基本性质来进行DNA或RNA定性或定量分析的一项技术。 分子杂交(hybridization)的概念 不同来源的具有互补序列的核酸分子形成互补双链（杂化双链）的过程。 探针（probe）技术 探针 序列已知的标记（放射性同位素等）核酸分子。 靶分子 * 探针 二、印迹技术的类别和应用 DNA印迹（ Southern blot） 点杂交和狭缝杂交（dot/slot blot） 原位杂交（In situ hybridization） 蛋白质印迹（Western blot） RNA印迹（Northern blot） 特点：灵敏度高（1~5ng），特异性好，固相膜保存时间长，可进行连续分析；无需放射性标记。 操作步骤： 蛋白质样品的制备； SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳： 蛋白质的电转移； 蛋白质与抗体的结合及显色。 Western印迹(免疫印迹） （根据分子量的大小分离蛋白质） 小 结（一） 1. 杂交、探针、原位杂交的概念。 2. 各种印迹方法的特点。 DNA的变性与复性 1/2 1/2 melting temperature Tm 核酸杂交概念图 变性转移 核酸印迹技术 待测核酸 探针 电泳 洗脱液洗脱 放射性自显影 分子量标准 Southern blotting Northern印迹杂交（RNA） 变性凝胶电泳 * * 防止RNA降解，操作条件高 用于基因表达检测，是最可靠的mRNA水平分析方法之一。 转移 固定 杂交 放射 自显影 点杂交和狭缝杂交（dot/slot blot） 优点： 可定性定量检测靶序列的存在与否； 没有电泳和转移的过程，操作过程完成较快，便于杂交条件的摸索。 杂交 放射自显影 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 缺点 不能提供核酸片段的大小，不能区分不同的靶序列。 1.