酵母菌细胞中分离醇脱氢酶.docVIP

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酵母菌细胞中分离醇脱氢酶

从土样中分离纯化酵母菌 满鹏程,王鹏,杨军刚,郑强 实验目的 1、学习从土壤中分离、纯化微生物的原理玉方法 2、学习、掌握微生物的鉴定方法 3、对提取的图样进行微生物的分离、纯化培养、并进行简单的形态鉴定 4、分离纯化醇脱氢酶 二、实验原理 1、基本思想: 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中,如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件,最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速,容易分离培养。在液体培养基中,酵母菌比霉菌生长快,利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养,然后在固体培养基上划线分离纯化。 2、基本路线: 采样→稀释→接种→鉴定→纯化→保藏菌种 三、器材和用品 1、器材: 小铁铲和无菌纸或袋、培养皿、载玻片、盖玻片、普通光学显微镜、量筒、滴管、吸水纸、无菌水试管、烧杯、三角瓶、电炉、玻璃棒、接种环、恒温培养箱、高温灭菌锅、移液枪(枪头)、天平、滤纸、pH试纸等。无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、显微镜、接种环,恒温摇床;光照培养箱;离心机;搅拌器等。 2、试剂: a、美兰染液。 b、马铃薯葡萄糖琼脂培养基:马铃薯200g(煮开10min后过滤取汁),葡萄糖20g,琼脂20g,水1000ml,pH自然。分装三角瓶;试管斜面1支/组。 c、乳酸马铃薯葡萄糖培养液:配方同上,不加琼脂加乳酸,按1000ml培养基加入5ml乳酸,pH为5.5左右,再分装试管9ml2支/组。 d、3mol/L的乙醇溶液,0.06mol/L的焦磷酸溶液,0.0015mol/L的NAD,0.01mol/L 的磷酸氢二钾溶液,丙酮。 硫酸铵;牛血清白蛋白;三羟甲基氨基甲烷;氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸[NAD]酵母菌;牛肉膏蛋白胨液体培养基;琼脂斜面培养基。 四、实验方法 1、采集土样 带上小铁铲和无菌袋到果园土、菜园土等地采集较细碎土壤。 2、样品稀释 在无菌纸上称取样品5g,放入100mL无菌水的三角瓶中,手摇10分钟使土和水充分混合。用1mL无菌吸管吸取0.5mL注入4.5mL无菌水试管中稀释。 3、分离 在上述样品稀释液中,吸取lmL,接种灭菌了的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上,倒置于37℃温箱中培养48小时。 4、加富培养:用无菌吸管取上述培养液1ml,注入另装有乳酸马铃薯葡萄糖培养液中,在28-30℃培养箱中培养24h。 5、镜检: 用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上,中央滴一滴美兰染液,混和均匀后制成水浸片,在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式,并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞,因活细胞使美兰染液还原,故菌体不着色。 6、涂皿:用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板,用无菌吸管取0.1ml加富培养液到平板中,用涂棒涂匀后培养24h。 7、分离纯化:用接种环挑取单个酵母菌菌落,在平板上四区划线,培养后分离得到单个菌落。 8、镜检:挑取单菌落,制片观察其形态。 9、菌种保藏:接种酵母菌到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上,长出菌苔后冰箱保藏。 从酵母细胞中分离纯化醇脱氢酶 实验方法 取以上菌体细胞,加入磷酸氢二钠溶液,37℃左右搅拌2h,再在室温下继续搅拌3h,3000r/min离心15min,保留上清液。 酶的纯化 将粗抽提液迅速加热到55℃,并不断搅拌,维持15min,然后迅速冷却至0℃,4000r/min 离心5min,保留上清液。 用饱和度分别为10%,20%,30%,40%,45%,50%,55%,60%,65%的硫酸铵分段盐析沉淀上清液,离心收集沉淀物,用Tris-HCl缓冲液溶解。 取45%~60%饱和度的盐析沉淀,溶于50mmol/L Tris-HCl(pH8.6)缓冲液中,葡聚糖凝胶层析柱,用相同缓冲液洗脱。 收集洗脱出的具有活性的酶液,上离子交换层析柱,用浓度为0.1~0.4mol/L的NaCl梯形梯度溶液洗脱。 1 酶活力的测定 于石英比色皿中加入3mL0.05mol/L缓冲液,40μL 0.05mol/L NAD溶液,40μL 17mol/L C2H5OH溶液后混匀,再加入一定量的酶液,快速混匀后立即在340nm处测定吸光度变化值,计算酶活力。以每分钟催化1μmol底物转化为产物的酶量定义为一个酶活力单位(U)。 1 蛋白质浓度的测定 采用Folin-酚试剂法[6],以牛血清白蛋白作标准曲线。

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