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第七章 微生物的生长及其控制 第一节 微生物的生长规律 7.1.1 微生物培养和群体生长 微生物的培养：在实验室或在工业上，使用培养基和培养容器，在特定培养工艺和培养条件下，人工培养微生物，获得微生物菌体或代谢产物的过程； 在培养过程中，微生物的个体生长表现为细胞组分的均衡增加，细胞形态略有增大； 微生物的繁殖导致个体数量或生物量有规律的增长，表现为群体的生长；群体生长与培养条件（培养基和环境因素）密切相关； 微生物的纯培养 在人工培养条件下培养微生物，通过繁殖而得到的微生物群体称为培养物（culture）； 只有一种微生物的培养物，或者由单个细胞繁殖得到的微生物群体，称为纯培养物（pure culture），简称纯培养； 微生物的实验室培养和工业发酵，一般都是纯培养； 微生物由于个体微小，很容易混杂，需要经常性的进行菌种纯化，以获得微生物的纯培养； 纯培养的分离方法 平板单菌落分离法：使微生物的单细胞或单孢子充分分散，彼此分开，然后涂布在固体平面培养基上，培养后长出的单菌落，很可能是由一个细胞或孢子繁殖形成的纯培养； 平板划线法分离法 稀释涂（倒）平板法 显微操纵器分离：借助显微镜和显微操作工具，直接分离单细胞（单孢子），然后接种培养； 用接种环取一环菌悬液或菌苔，在平板上划线； 每画一组平行线，灼烧接种环一次；反复划线、可拉出单细胞； 将待分离材料制备成悬液，使细胞或孢子充分分散；用10倍稀释法稀释，取适当浓度的稀释液，涂布平板或与培养基混合后倒平板： 微生物的培养方法 根据培养基物理状态和培养规模，好氧微生物培养方式分为： 固体斜面培养、固体平板培养、茄子瓶培养、大规模固体发酵；半固体试管培养； 摇管培养、摇瓶培养、小型发酵罐培养、大规模深层搅拌液体发酵； 实验室培养厌氧菌需要驱除和隔绝氧气；工业厌氧液体发酵； 发酵罐微生物液体培养方式 在微生物生理代谢基础研究，或者微生物工程应用中，大多使用发酵罐（生物反应器）进行液体培养； 分批培养（batch culture）：指恒定体积的液体培养，从接种开始，直到培养结束，在培养过程中不补充营养，也不移出培养物； 流加分批培养：在培养过程中，不断流加营养物，培养体积不断增加； 连续培养：在培养过程中，不断流加营养物，同时不断移出培养物； 微生物工业发酵过程 发酵工程包含三个过程：上游技术（微生物遗传育种技术）、微生物发酵过程和下游技术（分离工程）； 微生物发酵过程包含同时进行的微生物培养过程和微生物反应过程； 在工业微生物发酵过程中，既要控制微生物的生长，又要控制微生物的代谢；通常的微生物培养仅需要控制微生物的生长； 控制微生物生长，必需了解微生物的生长规律，清楚影响生长的主要因素； 青霉素G的发酵生产工艺——发酵（反应）过程 种子培养：产生健壮和大量的种子； 产黄青霉接种到固体培养基上，在25℃下培养7天，收获产黄青霉的孢子； 将孢子洗脱下来，制备孢子悬液，接种到液体种子培养基中，在27℃下，种子罐通气搅拌培养24h； 发酵培养（微生物反应）：获得大量次级代谢产物； 将种子培养液接种到发酵罐中，在27℃下，通气搅拌培养7天，期间流加苯乙酸，作为合成青霉素的前体物； 种子扩大培养和发酵的工艺流程和工艺条件 工业发酵：通过控制微生物的培养条件，使微生物正常生长，并大量积累目标代谢产物； 微生物培养物的定量测定，称为生物量测定；测定对象不同，方法不同，单位也不同，但可互相校正； 显微镜直接计数法：测单细胞或单孢子； 平板菌落计数法：测单细胞或单孢子； 细胞湿重和干重法：测定单细胞或丝状微生物； 分光光度法：测单细胞或单孢子； 生理指标法：测定单细胞或丝状微生物； 显微镜直接计数法：是在显微镜下，用血球计数板对单细胞或单孢子直接计数，单位为：个数/mL； 显微镜直接计数法不能区分死菌与活菌 ，称为全菌计数法； 血球计数板是一块特殊的载波片，在中间的两个平台上各刻有一个大方格网；大方格网由九个大方格组成，中间的正方形大方格为计数室； 计数室边长1mm、高0.1mm，体积0.1mm3 （10-4 ml） 计数室被划分为25个中方格，每个中方格分为16个小方格，共400个小方格；上面盖上盖玻片； 将待测菌悬液适当稀释后，涂布在平面培养基上，培养后进行菌落计数，一个菌落相当于一个活细胞； 平板菌落计数属于活菌计数法，适用于单细胞或单孢子计数，单位：菌落形成单位/mL（cfu/mL）（colony forming unit，cfu) 10倍稀释法制备待测菌悬液，选择适当的稀释度，定量（0.1~0.2mL）取稀释液涂布平板，或者定量（1mL）取稀释液与融化后冷却至45℃的培养基混合倒平板； 培养后，对长出的单菌落计数，根据稀释倍数，得到原菌液的生物量：cfu/mL 单细胞或丝状微生物的生物量均