实验十二杀菌剂的生物测定孢子萌发法.pptVIP

实验十二　杀菌剂的生物测定——孢子萌发法 * * 一、试验目的 学习并掌握杀菌剂的生物测定方法之一------孢子萌发法。 将孢子培育在含有一定药剂的介质中，在保温、保湿条件下培养一定时间后镜检，根据杀菌剂对病原真菌孢子萌发抑制作用来测定药剂的生物活性。 二、试验原理 载玻片 含药介质 孢子 孢子 含药介质 其他药剂选用合适的溶剂（如丙酮、二甲基亚砜、乙醇等）溶解，用0.1%的吐温80无菌水溶液稀释。根据预备试验，设置5-7个系列质量浓度，有机溶剂最终含量不超过2%。 三、实验步骤 （1）药剂配制 水溶性药剂直接用无菌水溶解稀释 （每毫升1×105-1×107个孢子，并加入0.5%葡萄糖溶液） （2）孢子悬浮液配制 培养基上的病原真菌孢子 洗脱 过滤 离心 （1000r/min）5min 倒去上清液，加入去离子水 离心 去离子水将孢子重悬浮 然后架放于带有浅层水的培养皿中，加盖保湿培养于适宜温度的培养箱中。 （3）药剂处理 低浓度 高浓度 孢子悬浮液 0.5mL 药液 0.5mL 混合均匀 微量加样器 凹玻片 四、结果调查与统计分析 当空白对照孢子萌发率达到90%以上时，检查各处理孢子萌发情况。每处理各重复随机观察3个以上视野，调查孢子总数不少于200个，分别记录萌发数和孢子总数。孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发。同时还应观察记录芽管生长异常情况、附着胞形成数等。 实验结果统计 CK 多菌灵 硫酸铜 机率 更正萌发% 孢子萌发% 孢子萌发数 检查孢子总数 浓度对数 浓度ppm 处理 ● 计算各处理的孢子萌发相对抑制率，采用浓度对数-几率值法计算各药剂的EC50、EC90,标准误及其95%置信限，评价供试药剂对靶标菌孢子萌发的抑制活性。 ● 但在观察试验结果时，除要观察孢子萌发与不萌发这两种截然不同的形态外，更要注意萌发芽管的形态变化，即芽管是否有膨大现象，是否有附着器形成，附着器颜色的深浅，发芽管长度、以及侵入菌体形成情况等，即从微细观察中来了解药物的作用方式。 ● 孢子萌发法的突出优点是快速，试验当天即可获得结果，尤其适合于保护剂的筛选。 *