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改善激光共焦扫描显微镜像质的方法 　　摘要： 为解决传统光学显微镜样本上每一点的图像都受到邻近点衍射或散射光干扰的问题，研发了一套基于C# WinForm控制平台进行连续扫描方式的激光共焦扫描显微镜（LCSM）系统，并且成功地对生物细胞进行了扫描成像。针对共焦显微镜图像像质不高的问题，提出合理选取探测器针孔直径，并通过高斯低通滤波、盲解卷积的方法，确保实现高像质。实验结果表明，基于上述方法改进后的LCSM具有较高图像质量，该方法简单易行，便于实施。 　　关键词： 显微镜； 图像质量； 高斯低通滤波； 盲解卷积 　　中图分类号：O 436 文献标志码： A doi： 10.3969/j.issn.1005-5630.2016.05.012 　　文章编号： 1005-5630（2016）05-441-04 　　引 言 　　光学显微镜是研究物质微观领域的重要手段，尤其是在生物医学[1-3]和材料科学[4]等领域。普通光学显微镜在成像分辨率和聚焦深度上存在明显缺陷[5-8]。激光共焦显微镜采用与传统光学显微镜完全不同的成像技术，具有很好的成像质量和层析成像能力，可用于观察活体样本的深度组织。 　　在共焦显微镜成像中影响图像分辨率和清晰度的因素主要有噪声和离焦量，其中噪声主要包括随机噪声和工频噪声。采用斯坦福公司的MODEL SR570前置放大器能够很好地抑制随机噪声，在数据处理时以均值滤波的方式进一步滤除随机噪声。对于交流电产生的工频噪声，本文选择高斯函数构造数字低通滤波器的方法进行滤除。 　　由于德国PI公司的位移台在移动过程中会使系统机械结构抖动，造成系统离焦，降低图像质量。对图像的离焦模糊处理方法有盲复原和非盲复原两种方法。非盲复原包括逆滤波算法和维纳滤波算法。逆滤波算法在有些区域使得传递函数为零或者很小时，噪声会在这些区域被放大，严重影响了图像的复原；维纳滤波复原算法效果良好，计算量低，并且具有很好的抗噪性。盲复原中的迭代盲解卷积算法简单直观，有继承性，并且能将逆滤波、维纳滤波复原算法应用于其迭代过程中。因此，本文在图像复原中采用迭代盲解卷积算法。 　　1 反射式LCSM的工作原理 　　激光共焦扫描显微镜（LCSM）采用共轭焦点技术，使激光光源、被探测点和探测器处在彼此对应的共轭位置[9]。用于激发荧光的激光束经过准直系统后通过显微物镜会聚，入射于待观察的标本内部焦点处，激光照射所产生的荧光和少量反射激光一起被物镜重新收集后，送往分光镜，其中携带图像信息的荧光由于波长比较长直接通过分光镜，并由收集物镜聚焦到探测器。由于分光镜的分光作用，残余的激光被分光镜反射，不会到达探测器。PI位移台载着待测样本按照指定扫描路径运动，从而完成对样本的扫描采集，然后经计算机处理，显示出样本细胞图像，整个系统如图1所示。在焦平面之前的光在探测器针孔的后端聚焦，大部分光被针孔光阑的边缘所阻挡，无法到达探测器，在焦平面之后的光聚焦在探测器针孔之前，大部分光扩散在针孔光阑的边缘，也无法到达探测器。焦平面上的光都聚焦在探测器针孔上，可以被探测器完全探测。这种能够抑制焦平面之外杂散光的特性赋予了共焦显微镜进行深度鉴别和层析成像的本领。 　　2 改善LCSM像质的方法 　　2.1 选择针孔大小 　　LCSM探测针孔大小起着至关重要的作用，会直接影响系统的轴向分辨率和信噪比。如果针孔过大，会引入杂散光，失去层析能力；如果针孔太小，则会降低到达探测器的光强，对探测器灵敏度具有较高的要求，同时影响图像的信噪比。研究表明[10]，当小孔直径等于艾里斑的直径时，探测效率可达85%以上，且能满足共焦的要求。物镜聚焦光斑经过无限远光学系统放大后，其在针孔处像的直径为 　　式中：β为系统的放大倍率；λ为入射光波长；NA为系统的数值孔径。该系统β=40，λ=405 nm，NA=0.95，根据式（1）计算得到艾里斑像的大小为20 μm。因此，该系统选用直径为20 μm的针孔。取样间隔遵循的原理是衍射极限定理，能够区分两个艾里斑的取样间隔为艾里斑半径。因此，将取样间隔定位在0.25 μm左右时，即可满足高分辨率图像的要求。 　　2.2 数字滤波处理方式 　　随机噪声具有很宽的频谱，若采用低通滤波，会造成图像的细节丢失。在避免细节丢失的处理中，传统多帧求平均方法会使扫描时间成倍增加。为此，本文提出了一种基于均值滤波滤除随机噪声的方法。 　　对于均值滤波滤除随机噪声的方法，由于数据采集卡的采样频率较高，在位移间隔内可以采集很多点（假设采集K个数据点），将这些值累加后平均或者加权求平均即为该点的能量值。 　　由于数据采集系统中使用工业电，因此数据采集的质量在很大程度上受到50 Hz工频的干扰，采集到的图像数据中将会包含工频干扰，严重影响重构图