QC-TY-2008菌种鉴定标准操作规程精读.doc

目的：建立菌种鉴定标准操作规程 范围：适用于质量控制部 内容： 1整体操作步骤 1.1纯化、分离待鉴定菌 用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。 1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。 1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。 1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。 1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。 1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。 2革兰氏染色 2.1染色剂的配制 2.1.1结晶紫染色液： 甲液：结晶紫 1.0g 95%的酒精 20ml 乙液：草酸铵 0.8g 水 80ml 将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。 2.1.2碘液： 碘 1.0g 碘化钾 2.0g 水 300ml 配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。 2.1.3稀石碳酸红溶液: 碱性品红 1.0g 石碳酸 5.0ml 95%乙醇 10.0ml 配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。 2.2操作: 2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。 2.2.2干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过2～3次，以固定涂片。 2.2.3染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本， 染色1分钟。 2.2.4水洗：斜置玻片使很细水流的纯化水从染色标本的上端流下，勿使水流直接冲刷涂片处，直至洗下的水呈无色为止。 2.2.5滴加碘液冲去残水并媒染约1分钟，用纯化水冲去碘液吸干。 2.2.6滴加95%的乙醇脱色约20～30秒，脱色时应将玻片微振动，使酒精分布均匀，立即用水冲净。 2.2.7稀石碳酸红溶液染色1分钟后，用水洗净晾干或吸干。 2.2.8镜检：先用低倍镜观察，找到适合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用100倍物镜观察细菌革兰氏属性。革兰氏阳性菌染色成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成红色，同时做阳性对照。 3简单染色 3.1用于真菌与细菌的鉴别。 3.2操作: 3.2.1 涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。 3.2.2干燥固定：涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干，并在火焰上通过2～3次，以固定涂片。 3.2.3染色：在已固定的标本上滴加结晶紫溶液数滴，使染色液覆盖整个涂片标本，染色1分钟。 3.2.4水洗：斜置玻片使很细水流的自来水从染色标本的上端流下，勿使水流直接冲刷涂片处，直至洗下的水呈无色为止，自然晾干或吸干。 3.2.5镜检：先用低倍镜观察，找到适合的位置，再加一滴香柏油于涂片上，使用100倍物镜观察菌体形态。 4 3%氢氧化钾试验 4.1材料 3%KOH溶液（W/V）、无菌木质牙签、待检菌的新鲜纯培养物（18～24小时）。 4.2操作 4.2.1在一洁净的载玻片上等距离滴上3滴3%KOH水溶液。 4.2.2用铜绿假单胞菌或具有等同反应的菌种作为阳性对照。 4.2.3用枯草