槐耳菌中的多糖成分具有抗腫瘤潜在性以及免疫调节.docVIP

槐耳菌中的多糖成分具有抗肿瘤潜在性以及免疫调节作用 摘要 从槐耳实体中分离出的中性的水溶性多糖(W-NTRP)，分子量为2.5x104道尔顿。气相色谱分析法（GC）研究结果表明这种水溶性多糖是由半乳糖、树胶醛糖和葡萄糖所组成的，相对摩尔比为4.2:2.5:0.7。它的抗肿瘤和免疫调节活性均与体外评估。这种水溶性多糖在三个胆管细胞型肝癌患者的细胞株中(QBC939, Sk-ChA-1 and MZChA-1)起到了显著的抑制作用，其半抑制率（IC50）分别为47.8、75.9和43.7ug/ml，而且对于L-929（小鼠成纤维细胞）没有细胞毒性。此外，这种水溶性多糖对于小鼠脾细胞【无论是否具有刀豆球蛋白A(ConA)和脂多糖(LPS)】具有增殖促进作用，此项研究具有钟形（正态分布）的剂量反应方式。再者，W-NTRP可以通过上调诱导NO合酶活性来显著的刺激巨噬细胞产生一氧化氮（NO）。这些结果表明W-NTRP作为胆管细胞型肝癌的抗肿瘤药物具有一定的研究价值。 1.引言 槐耳是一种生长在槐树树干上的浅褐色伞菌，属于伞菌类，担子菌亚门（Anithworth，Sparrow，Susman，1973）。这种真菌已经应用于传统中药将近1600年(Li, Ye, Wang, Tang, 2006)，首次由中国明朝李时珍所记录下来。大多数（即便不是全部）担子菌含有具有生物活性多糖蛋白或者多糖，它们存在于菌体、培养的菌丝或者培养基中，具有着抗肿瘤及免疫调节活性(Wasser, 2002)。在近几十年中，槐耳被人们发现并且作为一种补充药剂应用于癌症的治疗中。从槐耳中提取出的水分主要是多糖蛋白，它已经被证实是槐耳抗癌和免疫增强作用中的主要活性成分(Cui, Goh, Archer, Singh, 2007)。作为一种抗肿瘤药物，槐耳已经在肝癌的治疗中取得了令人满意的成效。累积的证据表明槐耳的抗肿瘤机制主要是抑制内皮细胞的增生，干扰肿瘤血管的生成(Xu, Jia, Ma, Yu, 2003)，免疫系统的激活(Chen, Lu, Lu, Li, 2004; Jia, Dong, Lu, Guo, Wei, 2009)，诱导肿瘤细胞凋亡以及抑制肿瘤细胞增殖(Zhu et al., 2008)。尽管槐耳在肝癌中取得了有效的治疗成果，但到目前为止，还没有证据表明其在胆管癌中的作用，并且它潜在的作用机制很大程度上仍是未知的。众所周知，胆管癌是一种恶性肿瘤，这种肿瘤来源于肝内和肝外胆道系统的胆管上皮细胞或胆管细胞(de Groen, Gores, LaRusso, Gunderson, Nagorney, 1999; Shaib El-Serag, 2004)，胆管癌由于它特殊的生物学特性因而预后差、复发率高并且对于放疗化疗易耐药。因此胆管癌被认为是一种多重耐用和耐放疗的肿瘤，并且具有高死亡率(Sirica, 2005)。胆管癌全球发病率的增加迫切需要新颖和有效的治疗药物，并且其没有与当前治疗药物相关的毒性作用(Schwartsmann et al., 2002)。自上个世纪以来，我们医院（哈尔滨医科大学附属第二医院）就已经将槐耳应用于胆管癌患者从而延长患者的生存时间或者减少复发率。为了使我们医院的药物制剂成为开放获取的药物，我们将做一系列实验研究去证实槐耳在胆管癌中的有效性。当前研究我们将从槐耳中提取水溶性多糖，在体外初步检测其免疫调节和肿瘤抑制活性。 2.材料和方法 2.1 材料 槐耳的实体来自于河南利民生物科技有限公司。标准糖，扬右旋糖酐，牛血清蛋白（BSA），3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑（MTT），三氟乙酸（TFA），刀豆球蛋白A（ConA）以及脂多糖(LPS)来自于西格玛化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。DEAE-52纤维素，琼脂糖CL-6B以及交联葡聚糖G-100来自于安玛西亚（瑞典）。所有其他化学试剂皆为分析级药品。 2.2 多糖的分离和提纯 槐耳的实体(0.5 kg)将置于100℃95%酒精中1.5小时以去除脂质，残留物将于1:15(w / v)沸水中3小时提取两次。经过离心分离后，上层清液浓缩10倍而沉淀物则用(1:4,v / v)乙醇于4?C过夜。将离心收集的沉淀物悬浮在蒸馏水中用沙葱多糖Sevage法去除蛋白质(Staub, 1965)。待多糖经过两天透析出水分后，浓缩的透析液将于4容量的95%酒精中沉淀，之后用纯乙醇、丙酮和乙醚进行清洗，以获得槐耳中的粗多糖。 将粗多糖（8g）溶解于蒸馏水（100ml）中，装填于DEAE-52纤维素色谱柱中（2.0x40.0cm）。将色谱柱第一次用蒸馏水洗脱，接着用5个梯度的0-2M氯化进行洗脱（0.2、0.5、0.8、1.0和