试验六1小鼠采精方法的研究.doc

实验六、小鼠采精方法 中国比较医学杂志CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVEMEDICINE 2005年4月第15卷 第2期April, 2005 Vol.15 No.2 郑新民,李聚学,魏 雁,乔宪凤,周荆荣 (湖北省农科院生物技术研究所,武汉 430072 小鼠是世界上研究最为详尽的哺乳类动物[1]。但是目前人们仍然是通过手术法从小鼠附睾中获取精子,国内外尚无小鼠非手术法采精的报道。手术法采精为众多的科学研究带来了不便:(1)手术法采精必须将雄鼠处死,分离其附睾和输精管来获取精子,过程繁琐,费时费工,且造成不必要的经济浪费[2]。另外,从附睾中获取的精子由于缺少副性腺中的诸多有益成分,精子品质难以保证[3];(2)不利于小鼠生殖生理的研究,在医学上,人们都是通过“杀鸡取卵”式地宰杀大量的雄鼠来获取精子进行科研分析[4-6],不但造成了很大的经济浪费,而且增加了实验的误差和难度;(3)不利于某些动物模型的建立,例如,由于小鼠精子获取繁琐,人工授精技术不易建立,精子载体转基因技术尚无理想的动物模型,这极不利于该项研究的开展[7]。由此可见,建立一种方便快速的小鼠非手术法采精技术对解决小鼠手术法采精中存在的问题、小鼠生殖生理的研究和建立某些小鼠动物模型都是很有意义的。 1 材料和方法 1.1 实验动物 SPF级昆明小白鼠雄鼠,购自湖北省预防医学科学院。合格证号为:SYXK(鄂 1.2 小鼠假阴道抽吸器的制备 小鼠假阴道的制作:取一段长约2 cm,内径8 mm的软质透明塑料管,在其内侧套上一层厚度约0.1 mm的胶膜,胶膜要求透明且有良好的弹性。在塑料管中部钻一直径为2 mm的小孔,将一外径与小孔相当的硬质插管插入小孔中,深度与塑料管管壁厚度相当,小孔周围用强力胶水密封,向小管中轻轻吹入空气即可将塑料管内侧胶膜充起。将制好的小鼠假阴道与胶头吸管相连,小鼠假阴道抽吸器即制作完毕。 1.3 电刺激采精仪的制备 电刺激采精仪由电刺激发生器和直肠探子两部分组成。电刺激发生器由交流变压器、电流表、电压调节器,变频器,电源开关等部件组成。直肠探子可用小塑料管自行制成,探子上装有电极,电极与电刺激发生器插座用电线相连。电刺激采精仪的特点: 电压连续可调,范围为0~20 V;频率选择范围为0~50 Hz;通电间歇时间可根据不同情况自行选择。 1.4 小鼠采精实验 1.4.1 小鼠保定:利用筒式法保定小鼠,小鼠保定筒可用与小鼠体躯相似的塑料筒制成,塑料筒两端钻有插孔,一端锯有缺口。待小鼠钻入筒内后,迅速将铁钉插入插孔中,限制小鼠伸缩,即可将小鼠保定。将保定好的小鼠在筒内旋转,使其生殖器暴露在缺口中,以利精液收集。 1.4.2 小鼠徒手法采精:小鼠保定后,用75%的酒精将其生殖器消毒,待酒精挥发后,用手指轻轻按摩小鼠生殖器。 1.4.3 小鼠假阴道抽吸法采精:小鼠假阴道消毒后,用凡士林将其内侧胶膜润滑,从插管中轻轻吹入空气,待内侧胶膜充起后,迅速将插孔堵住,以防气体外逸。用手轻轻按摩小鼠生殖器,待小鼠阴茎勃起后,将阴茎迅速吸入37℃预热后的假阴道内,然后用手指挤压吸管胶头,小鼠阴茎便在管腔负压的作用下做活塞运动,这时可向假阴道内不断吹入气体,以增加胶膜对小鼠阴茎的压力。抽吸频率可由慢至快,直至小鼠射精。 1.4.4 小鼠电刺激采精:直肠探子用75%的酒精消毒后,用石蜡油或凡士林将其润滑,轻轻地插入小鼠直肠中,深度约2.5~3 cm。如在插入过程中遇有阻力,则表明小鼠粪便尚未排出,这时将探子退出,用手指轻揉小鼠下腹部,促使小鼠排便,然后再将直肠探子插入。打开电刺激采精仪,以频率为20 Hz,起点电压为2 V,占空比为5P5 s秒通电刺激,刺激30 s后,电压上升1~2 V,重复以上步骤,直到小鼠生殖器充血勃起而向外突出,这时应作好集精准备。 1.4.5 精液的收集:小鼠精液刚射出时为白色粘稠液体,但会在短时间内凝固成白色固体,因此应迅速收集精液到有稀释液的离心管中。如伴有淡黄色液体流出,则为尿液,应用灭菌纱布迅速擦干,以免污染精液。另外,在射精过程中,有透明液体伴随精液流出,可用移液枪将其收集。 1.5 总精子量和精子活率的测定 反复吹吸精液,待精子在精液稀释液中充分游离后,用血细胞记数板测定精子的密度和活率,然后根据稀释液的体积和所测定的精子密度计算总精子数。 表2 射精不同阶段精子量和活率的比较 Tab.2 Comparisons of spermatozoa quantity and motility at different ejaculation stages 项目 1 2 3 4 Item