木瓜蛋白酶的柔性固定化研究.pdfVIP

研究论文综述 2004年全国生物技术学术研讨会论文集 木瓜蛋白酶的柔性固定化研究 刘晓宁魏荣卿沈斌 (南京工业大学制药与生命科学学院，南京210009) 摘要：以双醛淀粉为柔性接枝链，对不同载体表面进行修饰后对木瓜蛋白酶进行柔性固定化， 通过对固定化条件的优化，得出：用此柔性载体固定木瓜蛋白酶所得到的固定化酶活力回收率 达约相当于手臂固定化的2～3倍．结果说明，双醛淀粉作为接枝链具有维持酶蛋白构象的柔性 作用，采用这种“柔性固定化”模型可以改善传统共价结合固定法及手臂固定化酶活力回收率 不高的缺陷．另外对柔性固定化酶的稳定性考察发现其稳定性远好于游离酶。 关键词i双醛淀粉，柔性固定化，固定化木瓜蛋白酶 l前言 酶的固定化技术大多集中在固定化方法、固定化载体选择及酶的活性等方面，而鲜见对固定化过程 中酶稳定性的研究。本文从高分子材料表面性质、结构与蛋白质的构效之间的关系为出发点，从分子水 平考虑改善载体表界面的特性，以提高固定化酶活力回收率。 酶与载体的共价偶联固定化的过程首先是酶蛋白分子与载体表面相碰撞的过程，而后才是载体表面 的活性基团与酶分子的活性基团反应偶联固定化。而该碰撞力可能使酶蛋白分子的正常(天然)构象不 能得以维持【卜31。所以，如果能从分子水平考虑改善载体表界面的特性，使酶分子在碰撞反应过程中维 持正常构象，则有望提高固定化酶的性能。于是人们在固定化材料表面与酶蛋白之间接入短的间隔链(手 臂分子spacer)，进行酶的固定化【4。叭。但通常的手臂链较短，且有些是憎水的碳链，故固定化效果仍不 尽人意。基于林思聪就抗凝血生物材料表面性质与结构的关系提出的“维持正常构象”假说11．3】及Bayer 在多肽合成技术的综述中阐述的柔性链的作用机理【¨】，本文采用酶的“柔性固定化【12】”模型，即：在 固定化载体上，接枝一些有足够长度的且亲水的柔性分子链，而后再将酶结合到该接枝链上。这些柔性 链可通过其链结构的柔顺性来延长酶(蛋自分子)与载体分子作用时间而减少其反冲力i2，3】(图1)，从 而达到固定化酶时可维持正常构象的目的。在设计酶的“柔性固定化”载体时，本文选择了亲水性及生 性固定化，并研究了该固定化酶的稳定性。 捆t 缓冲 固定 ④1 ． m 缫谢铤 矿 7册．髂、．弱蠖①．目 圈1 圈定化过程中t体．E秉性麓对冀蛋白的曩冲作用 2结果与讨论 2．1壳聚蕾t体固定木瓜蛋白毫 ％ 3∞4年全国生物技术学术研讨会论文集 ，，。 研究论文综述 载体分别对木瓜蛋白酶进行固定化，其结果见表1。 裘1不同免聚着．DAS张t体及亮聚I|．GA手臂t体嗣定化一活力回收率的比较 由表l可知，当壳聚糖载体表面担载了柔性长链(DAS)时，其固定化酶活力回收率最高相当于壳 聚糖．GA手臂载体的3倍。其原因可能是：由于本文合成的柔性载体的表面接有亲水的长链，如同水中 海藻的结构12】缓冲了酶分子与载体的直接碰撞，使酶分子受到的力大大削弱，酶分子的原构象得以维持， 因此，酶活损失较少，而壳聚糖．GA手臂载体固定的酶活回收率较低则可归因于戊二醛的手臂链在酶固 定化的过程中虽有一定作用，但因链短不能达到有效的缓冲。另外，壳聚糖．DAS柔性载体的长链还可 使被固定在其表面上的酶蛋白改善其固定束缚作用，而保留较大的自由度，保留较多地酶游离态的均相 催化活性，从而得到较高的固定化酶活力回收率【1¨。 由表1还可知，在固定化过程中DAS氧化度适中的壳聚糖．DAS50柔性载体，其酶活回收率最高。 氧化度过低或过高，都会使酶活回收率降低。其原因可能是，氧化度过低，载体对酶的固定化不稳定； 有文献fl6】报道，过量戊二醛为交联剂固定酶时，会导致酶分子间的过度交联而失活，所以DAS的氧化 度过高，即载体柔性链上醛基