实验六分离、纯化微生物及无菌操作技术.ppt.ppt

实验六 分离、纯化微生物及无菌操作技术 石陆娥 shilue@126.com 实验目的和内容 目的：1.学习从日常生活中分离微生物的方法 2.掌握相关的无菌操作技术。 内容： 1.用稀释法分离微生物。 2.用平板划线法分离微生物。 3.学习斜面接种等无菌操作技术。 实验材料和用具 已灭菌的MRS培养基，无菌水(带玻璃珠)，已灭菌的试管，无菌培养皿，1mL无菌移液管，样品及天平、称量纸、药勺、试管架、记号笔、橡皮头(用75%乙醇浸泡)等。 实验步骤 一.稀释法分离微生物 1制备稀释液(要无菌操作) (1)制备样品悬液：称样品0.5g，迅速倒入带玻璃珠的49.5mL无菌水瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡5～10min，使样品充分打散，即成为10-2的样品悬液。 (2)稀释：用无菌移液管吸10-2的样品悬液0.5mL，放入4.5mL无菌水中即为10-3稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入样品悬液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。 2混菌法测定菌落数 (1)乳酸菌：取10-7、10-6两管稀释液各1mL，分别接人相应标号的平皿中，每个稀释度接两个平皿。然后取冷却至50℃的MRS培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高1.5～2mm为宜)，迅速轻轻摇动平皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成乳酸菌平板。倒平板时要注意无菌操作。 (2)培养: 将接种好的乳酸菌平板倒置，即皿盖朝下放置，做好标记（写上接种日期、接种人等），于37℃恒温培养中培养24h，观察生长的菌落，用于进一步纯化分离。 二.平板制作及划线分离方法 1．倒平板 右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手解下线绳，取下透气膜，三角瓶口保持对着火焰，左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约25ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。 2. 划线分离 使用接种环，从待纯化的菌落中沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法多样，目的是获得单个菌落，常用的划线方法有下列两种： （1）用接种环以无菌操作挑取样品悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线的部分作第二次平行划线。划线完毕后，盖上培养皿盖并倒置。 （2）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上培养皿盖并倒置。 3. 培养 将接种好的乳酸菌平板倒置，即皿盖朝下放置，做好标记（写上接种日期、接种人等），于37℃恒温培养中培养24h，观察生长的菌落，用于进一步纯化分离。 三.斜面接种 （1）取新鲜MRS固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），然后用无菌操作方法，把已分离纯化的菌种接入以上新鲜培养基斜面上。 （2）接种的方法是，用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部，注意划线要轻，不可把培养基划破。 （3）接种后37℃恒温培养， 24h后观察生长结果。 思考题 1．在测定微生物含量中，除混菌法外还可用什么方法? 2．试设计实验，从土壤中分离出酵母菌，并进行计数。 *