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魅力PCR—— 酶与缓冲液的珠联璧合 北京全式金生物技术有限公司 PCR原理和収展 PCR酶的分类 PCR酶的性能 PCR技术的类型 反应体系与条件的优化 PCR检测中的常见问题 PCR原理 PCR ：Polymerase Chain Reaction——聚合酶链式反应 核心：耐热DNA聚合酶 PCR 技术的収展 ? 第一代PCR – 定性 PCR 技术，借助电泳对扩增反应的终产物迚行半定量 及定性分析 ? 第二代PCR – 荧光定量 PCR 技术（Real-Time PCR ，qRT-PCR ）。利 用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增 产物量的变化，最终对起始模板迚行精确的定量分析 ? 第三代PCR – 数字 PCR （Digital PCR ）。它采用直接计数目标分子而不 再依赖仸何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分 子的绝对数目。 PCR酶分类 A型、B型DNA聚合酶三维结构 Kohlstaedt L A,Wang J,Friedman F M,Rice P A and Steitz T A,1992. Cristal structure at 3.5 angstrom resolution of HIV-1 reverse transcriptase complex with an inhibitor. Science, 256:1783~1790 提出了HIV-1 RT酶的右手结构模型 手掌：催化磷酸转移 手指：与合成中引入的核苷酸相互作用 拇指：与模板相互作用 Thomas A. Steitz, 1999. DNA Polymerases: Structural Diversity and Common Mechanisms, JBC 将该模型推广到所有DNA聚合酶 A型、B型DNA聚合酶三维结构 3’-exo的位置不同 A型聚合酶（Taq 酶系列） ?高扩增产量（ ≤5 kb ） ?较低的保真性 ?3’-A ?具有5’ -3’外切酶活性，用于探针法的荧光定量 ?宽泛的反应条件 ?对抑制物（盐、血、酚等）敏感 ?难以扩增复杂模板（高GC 、二级结构等） B型聚合酶（Pfu 酶系列） ?高热稳定性 ?高保真性（ 3’?5’ 外切酶活性） ?低扩增产量 ?反应条件较苛刻 复合酶 Barnes, W. (1994) PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from l bacteriophage templates. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 2216 –2220 ?一定比例A型聚合酶与B型聚合酶的混合物 （或用具有更高核酸外切酶活性的蛋白取代B型聚合酶） ?高扩增产量 ?高合成长度 ?保真性介于二者之间（ 3’?5’ 外切酶活性） A型、B型及复合酶比较 A型酶 B型酶 复合酶 扩增效率 高 低 高 合成长度 较短（5kb ） 长 长 保真性 差 好 介于A 、B之间 5’→3’外切酶活性 有 无 有 3’→5’外切