脲酶的凝胶过滤分离纯化.ppt

凝胶层析原理 固定相：凝胶 （不带电荷，多孔网状，分子筛） 混合物随流动相流经固定相的层析柱时，依分子大小而分离 混合物样品随洗脱液运动： 一是随洗脱液垂直向下移动 二是作不定向扩散运动 实验原理 脲酶分子量(490kD)较大，脲酶粗制品通过交联葡聚糖Sephadex G-150层析柱 酶本身不能进入凝胶颗粒的网络内，而其他小分子物质及分子量较小的蛋白质可扩散进入凝胶颗粒。 用蒸馏水作为洗脱剂，分子量大的脲酶首先被洗脱下来，从而达到与其他物质分离的目的。 定时或定量收集洗脱液，绘制酶活性(洗脱)曲线 (NH2)2CO + H2O 2NH3 + CO2 实验具体流程 1.层析柱的制备 交联葡聚糖Sephadex G-150 1g 水 60ml 加热溶胀：沸水浴中加热5h，取出后冷却 至室温装柱 室温溶胀：需放置48~72h 6.洗脱与收集 在样品上加蒸馏水进行洗脱，流出的液 体分别收集到小离心管中 流速：4- 6s/滴（10-15滴/min）， 收集量：3ml/管(刻度离心管) 数量：共收集约8管(编号1, 2, 3…) （原则：澄清后再收集1-2管） 1. (NH4)2SO4标准曲线 实验具体流程 1.层析柱的制备 5.加样 2.装柱 6.洗脱与收集 3.调整流速 7.检测与制图 4.样品制备 8.层析柱再生 实验中用到的试管 实验中用到的试管 简答题 简述分光光度计及比色皿使用的注意事项 简述3种层析技术的原理及应用 由(NH4)2SO4标准曲线查得的NH3的umol数 计算的每管 酶活性(纵坐标) A480值 管号(横坐标) 8’’ 7’’ 6’’ 5’’ 4’’ 3’’ 2’’ 1’’ 原始记录及计算值 绘制酶的洗脱曲线： 每管的酶活性为纵坐标，收集管号为横坐标 2.脲酶活性的检测结果: 酶的活性（洗脱）曲线 洗脱收集的酶液： 1 2 3 4 5 6 7 8 0’ 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 8’ 9’ 酶促反应液： （表5 - 2） 脲酶活性检测的显色反应： （表5 - 3） 0” 1” 2” 3” 4” 5” 6” 7” 8” 9” A B C D E F G 硫酸铵标准曲线的绘制： （表5 - 4） * * * * * Gel bead：凝胶（有孔）小珠 Gel matrix：凝胶基质 Solvent：溶液（洗脱液） Small molecules：小分子 Large molecules：大分子 Amount of solute：溶质量 Volume of effluent：流出体积 Nessler试剂：奈斯勒试剂或称铵态氮试剂 脲酶的凝胶过滤分离纯化 分子医学实验教学平台 蛋白质凝胶过滤分离纯化的基本原理 层析技术的种类及原理 分光光度计的原理及使用 标准曲线的制备 实验目的 实验原理 脲酶 NH3· H2O +2K2HgI4 + 3KOH HgO · HgNH2I + 7KI + 3H2O (Nessler试剂) (碘化氨氧合汞) 脲酶活性测定: 氨与Nessler试剂反应生成黄色络合物 ，其吸光度与氨浓度成正比 洗脱液中酶活性单位数： 每毫升洗脱液每小时保温所能产生的氨的 umol数表示 吸光度 氨的umol数 酶活性 硫酸铵 标准曲线 公式换算 实验结果: 测定各管的脲酶活性酶活性为纵座标，管号为横座标，绘出酶活性（洗脱）曲线 实验大体流程 丙酮初纯化 大分子脲酶和 小分子蛋白 纯化 酶活性测定 粗提样品 计算，做图 加样 洗脱、收集（1, 2, 3…） 酶促反应（0