生物化学常用分子生物学技术的原理及其应用幻灯片.pptVIP

常用于研究基因表达的分子生物学技术有(X) A.Northern blotting B.Southern blotting C.Western blotting D.RT-PCR 利用聚合酶链反应扩增特异DNA的重要原因是反应体系内存在(A) A.DNA聚合酶 B.特异RNA模板 C.特异DNA引物 D.特异RNA引物 * 目录 * 目录 常用分子生物学技术的原理及应用 （考题少，在分子杂交与印迹技术及PCR技术中） 第21章 第一节 分子杂交与印迹技术 （2008年有一道题） 核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。 一、分子杂交与印迹技术的原理 复性 RNA DNA （一）印迹技术 利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。 用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 （二）探针技术 二、印迹技术的类别及应用 （一）DNA印迹 (Southern Blotting) （二）RNA印迹 (Northern Blotting) （三）蛋白质的印迹 (Western Blotting) 其他： 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip) 三种印迹技术的比较 分子杂交实验 ① ② ③ 第二节 聚合酶链反应 （2007年有一道题） 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA PCR技术的工作原理 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR体系基本组成成分 PCR的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C 第三节 核酸序列分析 Nucleic Acid Sequence Analysis 核酸序列分析的基本原理： 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (Sanger法) 一、DNA链末端合成终止法 G A T C 测序反应 电泳 AACGTGGACT AACGTGGAC AACGTGGA AACGTGG AACGTG AACGT AACG AAC AA A 5 3 正极 负极 ddG ddA ddT ddC 链末端合成终止法测定DNA序列的原理 第四节 基因文库 Gene Library 基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 基因文库(gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 一、基因组DNA文库 基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。 用于构建基因组文库的载体有?噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。 基因组文库和cDNA文库的构建和筛选 第一轮筛选 第二轮筛选 第三轮筛选 基因组文库筛选结果举例 cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 二、cDNA文库