实验四 外源基因的多重PCR检测幻灯片.pptVIP

外源基因的多重PCR检测 实验目的 通过多重PCR，比较、分析影响多重PCR的主要因素，掌握解决方法。 掌握多重PCR引物设计的原则和方法，确立多重PCR方法快速检测转基因植物中外源基因整合的条件，为更深一步应用多重PCR检测技术奠定基础 一 多重PCR技术的基本原理 　多重PCR方法目前在植物生物学研究上应用非常广泛，包括植物种质鉴定，植物病毒的检测和分子育种。多重PCR的关键是引物设计，主要原则就是避免引物内部形成发卡结构，引物及引物之间在扩增过程中产生二聚体。其他条件例如模板纯度，退火温度也能够影响PCR扩增效果。 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。类似于DNA的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 二 PCR的反应动力学 　 DNA扩增量呈指数上升。 反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示每次扩增效率的平均值，n代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期(Plateau)。 平台期产生的因素 ①dNTP和引物浓度下降 ②酶与模板的比例下降，能参与反应的 酶分子数下降 ③多次循环后酶与dNTP的稳定性下降 ④非特异产物及引物二聚体比例增加 ⑤产物浓度高时变性不完全，影响引物的延伸，并产物浓度过高10－8M时，降低Taq酶的延伸与加工能力。 设置变性-退火-延伸三个温度点 设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 对于较短靶基因（长度为100～300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸 ① 变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性 若低于93℃则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败 ② 退火(复性)温度与时间 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想 引物的复性温度通过以下公式帮助选择合适的温度 Tm值（解链温度）=4（G+C）＋2（A+T） 复性温度=Tm值-（5～10℃） 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性 复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合 ③ 延伸温度与时间： 延伸温度：一般选择在70～75℃之间 常用温度为72℃ 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些 引物设计 引物设计 根据bt， nptII和gus序列特征，使用oligo6.67结合primer premier 5.0软件设计三对引物，用于多重PCR和单重PCR扩增。引物参见表1。 表1 扩增DNA模板引物对的方向、长度、Tm值、GC含量以及理论上扩增产物的大小等相关参数 常规引物对不适于多重PCR检测，因为扩增过程中引物之间的干扰，产物片段长度的重叠都会影响多重PCR的准确性。为了防止在PCR过程中产生非特异性扩增，每对引物的设计都应当有相近的Tm值，GC%含量和长度，产物大小能够保证相差大于150bp，这样可以在琼脂糖凝胶电泳时产生可以区分的条带。引