改良LORRY法测蛋白质含量.pptVIP

实验室规则 实验要求 实验室安全： 实验服、口罩、手套 试剂和仪器的使用 禁止大声喧哗，保持实验环境的安静 实验室卫生 实验分组 实验报告格式 实验名称 姓名： 班级： 学号： 实验原理： 实验目的： 实验步骤：文字简洁，尽可能采用图表 实验结果：原始数据、计算过程、结论 实验讨论：结果分析、实验注意事项 实验日期： 同组人员： 总分100 ：50%为实验理论（闭卷） 50%为实验技能操作及平时 平时（包括实验报告和平时表现） 实验课的考核 ？？ ？ 实验安排 12临床药理、医学检验、药学 13护理班 13生工、药贸 实验四：谷丙转氨酶活性测定和竞争性抑制（227） 实验五：质粒DNA的提取与电泳（27） 实验一：改良Lowry氏法测定蛋白质浓度（1） 实验二：乙酸纤维素薄膜电泳和凝胶柱层析（1413） 实验三：血清甘油三酯含量测定（26） 试验六：聚合酶链式反应（28） 实验七：血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳（15） 一、玻璃仪器的常规清洗（P2-3） 实 验基本操作 清洗剂刷洗 自来水冲洗（至少5遍） 蒸馏水冲洗（2-3次） 干燥与放置 二、吸量管的使用（P3-4） 选、吸、平、减、吹 三、试剂瓶、吸量管、试管的放置 试剂瓶用后放回原处、标签面向同一方向 吸量管箭头朝下放置，以免倒流 空置干净试管倒扣放在试管架上 四、分光光度计的原理（P11） 光源 I0 I 单色器 样品池 狭缝 检测系统 T = I/I0， A = - lg T 1、A1/A2= c1/c2 2、标准曲线法 Lambert-Beer 定律 A= KcL 1. 打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热20~30min 2. 1档（空白管），T模式调100%，显示“Blank”、“100” 3. 拉杆拉至1.5档，T模式调0%，显示“0.00” 4. 切换到A模式，拉至2、3、4档，读取各个样品的吸光度 5. 使用完毕后，置于休息档（1.5档） 拉杆，1-4档 样品池 读数 波长 五、分光光度计的使用 1档，空白对照，A=0，T=100% 1.5档，隔板，A=+∞，T=0% 2档，样品1，A=？ 3档，样品3，A=？ 4档，样品4，A=？ 1、分清光面、毛面 手只可接触毛面，光线须从光面通过 2、用溶液润洗2-3次，装至2/3至4/5体积 3、粗纸吸水、柔纸擦亮光面 4、从低到高依次测量，不需清洗比色杯 5、蒸馏水冲洗3-5次，擦干，倒扣放置 毛面 光面 六、比色皿的使用 改良Lowry氏法测定 蛋白质含量 实 验 一 P28 实 验 目 的 1、学习改良Lowry氏法测定蛋白质含量 的原理及方法 2、了解标准曲线在物质定量测定中的 应用及绘制要点 实验原理 凯氏定氮法 16% 紫外吸收 280nm 呈色反应 Pr. Cu2+ OH- Pr-Cu2+ 螯合物 (紫红色) 酚试剂 钼蓝-钨蓝混合物 (蓝色，深浅与蛋白含量呈正比) （双缩脲反应） Pr. Cu2+ 改良Lowry法 费时较长，而且要精确控制操作时间。 显色程度与时间有关。 专一性较差，干扰物质较多。 灵敏度高 双缩脲法的检出限为 0.2~1.7 mg/ml， 而本法的检出限为0.015~0.110 mg/ml。 优 点 缺 点 实 验 步 骤 试剂 （ml） 蛋白标准品 样品 测定管 0 1 2 3 4 5 Pr标准液 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 待测血清 1.0 生理盐水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 试剂A 0.9ml, 混匀后，37℃水浴10min 试剂B 0.1ml, 混匀后，室温放置10min 试剂C 3ml, 立即混匀，37℃水浴10min 1、标准曲线的绘制和实测样本浓度的求得 实 验 结 果 0 x1 x2 x3 x4 Y3 OD650 蛋白质量（mg）/蛋白浓度（mg/ml） Y2 Y1 样品吸光度 样品浓度 2、浓度换算 样品体积 实测蛋白质量 待测蛋白浓度（g/L）= 实测蛋白浓度 ╳ 稀释倍数 待测蛋白浓度（g/L）= ╳ 稀释倍数 注意 终体积相同的前提下，可以用质量代表浓度 例如：1号管中，蛋白质量为0.02mg，而其终浓度为0.004mg/ml 注意溶液的稀释倍数 例如：若以浓度为横坐标，根据吸光度得到实测蛋白浓度为0.02mg/