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实验十一 扫描电镜样品制备 选作 二、实验用品 材料 植物的的根、茎、叶或动物的脏器等。 2. 试剂 丙酮、乙醇、2％戊二醛溶液、1％锇酸、0.1mol/L PH7.2磷酸缓冲液、醋酸异戊酯、液体二氧化碳、导电胶等。 3. 器材 扫描电镜、 临界点干燥法、真空喷镀仪、青霉素小瓶、培养皿、载玻片、牙签、脱脂棉等。 三、扫描电镜样品的制备 取样： 将取下的动植物组织放入预冷的含有2％戊二醛溶液的载玻片上，用刀片将组织块切成长4mm左右、高3mm左右的小块。 2. 样品的清洁： 把载玻片上切好的样品快，用牙签轻轻地逐个拨入盛有0.1mol/L PH7.2磷酸缓冲液的青霉素小瓶中漂洗，并反复更换用于清洗的缓冲液，一般漂洗1小时，换液3-4次。 3. 样品的固定 样品的固定、漂洗和脱水等处理所用的试剂和方法基本上与透射电镜的样品相同，但由于扫描电镜观察的是样品的表面，主要是要求保持样品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脱水过程也与透射电镜样品处理有不同之处。 一般在4℃的条件下完成固定比较好， 戊二醛、锇酸均可单独固定，也可用“戊二醛-锇酸”双重固定法。 固定1-3小时（依样品种类和固定剂而已）后，吸出固定液， 加入0.1mol/L PH7.2磷酸缓冲液，漂洗1小时，换液3-4次。 4. 脱水 从小瓶中吸出缓冲液， 加入乙醇逐级梯度脱水，脱水剂的乙醇浓度依次为30%－50%－70%－80%－90%－100%乙醇（两次）逐级脱水；样品在每级停留15-30分钟。 5. 置换乙醇 吸出乙醇，加入醋酸异戊酯与乙醇1：1的混合液，浸泡10-20分钟并适当摇动，再吸弃混合液，加入纯醋酸异戊酯浸泡10-20分钟并适当摇动。 6. 样品的干燥 常规临界点干燥法。 临界点干燥法 临界点干燥法是一种消除了物相界面(液相／气相)，也就是消除了表面张力来源的干燥方法。这种方法由于没有表面张力的影响，所以样品不易收缩和损伤。具体处理步骤如下： 装样： 将样品从醋酸异戊酯中挑入(或倒入)样品笼中，用滤纸吸去样品笼外围的醋酸异戊酯，然后连笼移入仪器的样品杯(高压容器)内，盖上盖并拧紧以防漏气。(注：在装样前，应先打开仪器电源，将温度调节设定在0℃处预冷10～15min，以保证液态二氧化碳有足够量进入样品杯中)。 注入液体二氧化碳 依次打开二氧化碳钢瓶排气阀和仪器的进气阀在0～10℃下，向样品杯注入液体二氧化碳。 当液体二氧化碳充至样品杯容积的50％(通过刻度尺观察，以液面超过样品笼为度)时，关闭仪器进气阀，静置15～20min，让醋酸异戊酯向液态二氧化碳中充分扩散，然后，打开仪器排气流量计阀门和进气阀门，让其边排气边充液10min左右，(让含有醋酸异戊酯的二氧化碳排出和充入新鲜的液态二氧化碳)再关闭排气阀；继续充入液体二氧化碳至样品杯的80％左右，关闭进液阀，停止充液。 加温置换：将温度调节设定在20℃处经15～20min后，由于温度升高，杯内液体二氧化碳逐渐气化，因此，压力也随之上升至7000Pa左右，样品中的醋酸异戊酯将与二氧化碳充分置换。 气化：将温度旋钮调至临界温度以上(35～40℃)，此时随着温度升高，样品杯内的压力也逐渐增加，达到二氧化碳的临介点，界面也随之消失。当压力达到7134Pa时，经5min后，即可排气。 排气：在保持温度不变的条件下(即不关电源)，打开流量计的排气阀门，以1.0～1.51／min的速度排气(速度慢些更好)。约经45～60min后，排气完毕，样品杯的压力下降到零，将温度调节至室温约5rain后，即可取出样品装台镀膜(若不能立即装台，应置于干燥器内保存)。 临界点干燥操作时的注意事项： 在样品放进样品杯前，样品杯应预先冷却至0～10℃。 样品不宜过湿，但也不能让其表面干涸，应在半干半湿时送入样品杯。因为过湿表明乙酸异戊脂太多会干燥后样品仍含有乙酸异戊脂，影响干燥效果。而过干又会因空气干燥而造成样品己变形，再进行临介点干燥也没有意义了。 一次加入的样品不宜过多，以免带进过多的中间液，使样品干燥不完全，另外，样品过多使二氧化碳量充入不足而达不到临界点。 充入液体二氧化碳的量要足。因为充液量不足，达不到临界值，起不到临界点干燥作用，一般充液量应达样品杯容积的2/3左右。 在加温气化时，实际操作温度应超过临界值，以保证达到充分的临界状态。 开、闭阀门时，动作要轻缓，尽量防止二氧化碳液对样品产生突然冲击而造成样品损伤。因此，样品笼的上下应垫上一层镜头纸或滤纸。排气速度也应尽量缓慢，一般放气时间应在．4Omin以上，有时也可以放气过夜或过中午。 7. 粘贴样品 用牙签