感染性疾病的分子诊断-幻灯片.pptVIP

基因病概念 1975年，Dulbecco 提出：人类的DNA序列是人类的真谛，包括癌症在内的人类疾病的发生都与基因直接或间接有关 1978年，Susumu Tinegawa：从人类所有的疾病都与基因受损有关的角度出发，提出了人类疾病新概念——基因病（genic disease） 中国：引起死亡的主要疾病 基因病的分子诊断 诊断分子（标志物） 核酸 蛋白质 多糖类 代谢物（生物小分子） 激素 代谢产物 基因病的分子诊断技术 基于核酸的分子诊断技术 bDNA PCR PCR类型：巢式PCR，等温PCR，…… 定性PCR PCR产物 ＋ RE酶切 → 电泳 PCR产物 ＋ RE酶切 → 杂交 定量PCR FQ-PCR（real-time PCR） 印迹：Southern/Northern blot Chip：micro-array 测序技术（sequencing） 支链DNA技术（branched DNA, bDNA） bDNA技术为一种核酸探针杂交标记信号放大技术 特点： 不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素少，因此稳定性、重复性高，结果准确。 操作简便：只需将待测病毒裂解释放出核酸，并将其变性为单链，即可进行检测，不需事先纯化 缺点： 就是放大倍数少、敏感性低、检测范围窄，不适用于低水平检测。 第一代bDNA技术的检测范围3.5×105~5.7×107copies/ml 第二代bDNA技术的敏感性有所提高，可2×105copies/ml 基因病的分子诊断技术 基于蛋白质的分子诊断技术 ELISA（酶联免疫吸附分析） Chip Western blot 2D 电泳 质谱 飞行时间质谱（TOF） LC-Mass，GC-Mass 核磁共振（NMR） 基因病的分子诊断技术 基于代谢组学的分子诊断技术 质谱 核磁共振 光谱 色谱 感染性疾病的分子诊断策略 一般性策略（检出病原体）： 判断有无感染 是何种病原体感染 常用方法：PCR ＋ 杂交 完整性策略： 检出病原体 分型（分类）－亚型－耐药性 常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序 感染性疾病分子诊断标志物 病原体核酸分子（DNA/RNA） 基因表达产物 代谢物 免疫应答分子 感染性疾病的分子诊断临床价值 定性或定量检测病原体的核酸，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染的诊断 动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和病情预后评价提供客观的依据 第一节 病毒的基因检测 检测病毒的方法 血清学检测 病毒分离鉴定（诊断的金标准） PCR技术（检出率最高） 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV） 全世界有3.5亿慢性携带者，75%在亚太地区 每年有一百万人死于HBV感染，是全球范围内第9位死因 中国：50%~70%的人受过感染，8%~10%是HBV携带者 急性感染时期HBV的标志物 HBV 基因分型 HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型： A型主要存在于白人， B型和C型主要存在于亚洲人群 E型主要存在于西非 F型仅见于中南美洲的土著人 G型和H型很少见 不同基因型序列长度不同，主要是前S1区的不同。我国流行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有较高比例的D型 HBV DNA FQ-PCR（real time PCR） 1．样本处理（样本处理区） 2．核酸扩增 2. 1 试剂配置（PCR前准备区） 2. 2 加样（样本处理区） 2. 3 PCR扩增（检测区） HBV DNA FQ-PCR（real time PCR） 1．样本处理（样本处理区） 样本100ul（待测血清或血浆，试剂盒中对照品） 0.5ml离心管中→加入100ul DNA提取液1，振荡混匀 13,000rpm离心10min；吸弃上清[离心时注意固定离心管方向、尽可能吸弃上清且不碰沉淀] 再加入25ul DNA提取液2，振荡10sec [沉淀需打散、混匀] 2,000rpm离心10 sec，100℃干浴或沸水浴10min 13,000rpm离心10min，保留上清备用. （如果样本裂解产物当天不使用，则要保存在-20℃） HBV DNA FQ-PCR（real time PCR） 2．核酸扩增 2.1试剂配置（PCR前准备区） 从试剂盒中提取出HBV PCR反应液、Tap酶及UNG，室温融化后，2000rpm离心10sec 设所需的管数为n（n=样本数+2管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照+4管阳性参控品） 每个测试反应体系配制如下表： 计算好各试剂的用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向