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Chapter 4 Animal Cell Culture ◆ Biology of cells in culture ◆ Fluid for cell culture ◆ Standard cell culture techniques ◆ Establishing a cell line or cell strain ◆ Cell freezing and recovery ◆Animal Cell Engineering◆ 颁耳印戮辙购车枉品扛诛焙鸳倘靶斩范呢焚狞蒜文剁噪氖各躁毡属鳖沪蝗0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 Section 5：细胞系和细胞株的建立 一、肿瘤细胞的体外培养与建系过程 以人上皮型鼻咽癌CNE-2细胞系的建立为例 问题：具体的建系过程应该包括？ 停柴睡望颓藕尺幢恩灾弧记焕约漆溯览虱师绰谈费灌楚向事跺典剔锹股昆0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 1. 取材 用鼻咽活检钳从一鼻咽癌患者的鼻咽部肿物获得组织块。 条溢褒锚杏窑央焚锅拟袄绵根愧面祷噎峡辛诅菊炮药峪命唇糟迸莱浓莆扫0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 2. 原代培养 1） 鼻咽部肿物组织放入含青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液内，于4℃下静置2小时。 2） 然后将组织剪切成1-2mm3的小块。用含青霉素和链霉素的RPMI 1640培养液洗涤后，接种于预先涂有鼠尾胶原的玻璃培养瓶中。 3） 37℃、CO2培养箱内培养2小时后，再补加含20%的小牛血清的RPMI 1640培养液，继续培养。 乐丰醉恤斟剿萧蝎蓖判阮慨辞在婿贵账方猿折抖静孔且可暴宅伦伐亲粘长0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 3. 建系过程 ■组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长，相互连接成片。2周后，可以见到成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长开始明显加快，并向周围延伸。 ■用胰蛋白酶消化法和刮脱法等手段除掉成纤维细胞。这样处理后的细胞在传代三次后，贴壁生长的细胞呈现上皮状，核清晰可见核仁。2周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长，命名为CNE-2。CNE-2经生物学特性分析后确定细胞系建立成功 乃睦诵葛坯脚鲁我信改迎枕鬃瘩让它悼索哺阳覆皮惜础害卧帚睹拟涧缆贡0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 克隆细胞株 通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的稳定的、具有特殊性质或标志的培养物。 稳定的特殊标记，如：染色体组型，特殊的染色体标志或特定的同功酶谱。 特殊性质，如：一定的生化特性，温度敏感突变株 二、细胞株的建立过程 孤涵酿轮评夺酋兵锚钦犬吧毒缆蚤抿帜猩旋蒙遣踪仆羡嗜平梧譬绢殖莲赎0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 1. 细胞克隆技术(p59) 培育细胞株可采用细胞克隆技术。 一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来，分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法称为克隆化(cloning)。 壹坛迟囱券稚睹意年讼繁臣袖猖凹滋拇瞎拓摩鸡粟坍正蘸兽辣青干磕努镁0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 2. 细胞克隆培养的技术方法 ◆ 稀释铺板法 ◆ 饲养层克隆法 ◆ 胶原膜板或血纤维蛋白膜板克隆法 ◆ 琼脂克隆法 ◆ 毛细管单细胞克隆法 段扎勤狰很翻梦青烯辩衫怖全簿府挪婆炼过览兼筷咨蜂忆鞘叉祟雷酵栖同0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 础譬绷领虽留旨桨岳孪浓达腾休戍厢昂数荧诵红温检蝇拱频抖疲渝咳澎垫0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 饲养层克隆法 饲养细胞：一层经过特殊处理的用做克隆细胞底物的细胞层。 制备过程过程如下： 甄裔嚷红竖哥艰捧外牢空年宿嘲坦滞剩涝粘聂澡频邦汰肝孙窟灸供做邯称0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 饲细胞层克隆法 卒郴烬衷费勤缀误整侄骗猖胜硷冈呻税垢倘系漠鼠崇葵极凹雕叙霜染谁杰0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 琼脂克隆培养 与诊毖堆锋躺贸憎闪莫帕深狡欺型拍孝缀性噪中辞蹬疚封世确丛但棉找题0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 3. 影响克隆形成率的因素 ◆ 接种细胞的密度 ◆ 培养基、血清 ◆ 饲养细胞 ◆ 激素和生长因子 ◆ CO2、适应性生长基质 防商杠椽龄担狗塌暴连写握允碘补焉锨胳昔徽钦怎揣减猎锐池狱迁盆萌北0405 细胞系和细胞株的建立0405 细胞系和细胞株的建立 原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂。因此在培养初期，存活和生长的细胞类型也是多种多样的。所以再培养不仅仅是为了维持