四君子汤对FCIR 大鼠大脑皮质神经保护作用的实验讨论.docVIP

四君子汤对FCIR 大鼠大脑皮质神经保护作用的实验讨论 　　脑缺血损伤过程中， 细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)在酶解作用下降解，导致细胞间信号传递失调，从而造成神经元损伤、凋亡。ECM 是构成血脑屏障的主要成分，也是神经元赖以生存的外环境和载体，能稳定神经系统内环境学，与中医学“脾土”的功能相似，ECM 的功能当属中医学“脾土”功能的范畴，因此刘旺华等提出健脾补土法治疗脑缺血的理论。 　　血管细胞外基质成分的合成和降解在正常生理情况下保持着动态平衡, 基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases, MMPs)参与了所有ECM 成分的调节，能够降解ECM 的大部分成分。脑缺血过程中， 微血管基底膜的损伤导致层粘连蛋白(laminin，LN) 表达减少，与纤溶酶原激活系变化有关; 组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitorof matrix metalloproteinases，TIMPs) 是MMPs 的特异性内源性抑制剂， 可阻断MMPs 与底物的结合，防止ECM 降解，TIMP1 为其家族主要成员之一。ECM 的降解可以破坏脑微血管结构的完整性，同时损坏血脑屏障，导致继发性脑水肿以及脑损伤。研究发现，健脾补土法组方能减少神经元凋亡对于脑卒中后遗症， 其机制可能是通过抑制MMP9 表达以及LN 降解。本研究从LN、TIMP1 和MMP9 蛋白的表达探讨健脾补土法名方四君子汤对大脑皮质的神经保护作用，探讨四君子汤脑保护作用的可能机制，以期为临床抗脑缺血/再灌注损伤提供新的思路。 　　1 材料 　　1.1 动物 　　清洁级SD 大鼠48 只， 雄性， 体质量280~300 g。动物由湖南斯莱克景达实验动物有限司提供，许可证号：SCXK(湘)2013-0004。常规饲养，运用12 h 交替光线进行照明，实验室通风良好，室温控制在21~26 ℃，相对湿度保持在40%~50%。 　　1.2 药物 　　选用健脾补土名方四君子汤(由人参9 g，白术9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g 组成)。水煎液浓缩为含生药2 g/mL，4 ℃ 冰箱冷藏备用。尼莫地平：购于德国拜耳公司， 规格30 mg， 溶于蒸馏水配成3.6 mg/mL 备用。 　　1.3 主要试剂和仪器 　　TIMP1 兔抗鼠多克隆抗体(Proteintech 公司)，MMP9 兔抗鼠多克隆抗体(Proteintech 公司)，LN 兔抗鼠多克隆抗体(Proteintech 公司)，PV-9000 二步法通用试剂盒(北京中杉金桥生物公司)，DAB 显色试剂盒(北京中杉金桥生物公司)。手动石蜡切片机(中国浙江金华)，显微摄像图像分析系统(麦克奥迪实业集团公司)。 　　2 方法 　　2.1 动物分组及给药 　　将48 只SD 大鼠随机分为4 组，对照组、模型组、尼莫地平组(10.8 mg/kg)、四君子汤组(6 g/kg)每组12 只。从造模前3 d 开始给药，每天1 次，剂量根据人临床剂量按动物体表面积换算，对照组、模型组大鼠用等体积蒸馏水灌胃。连续灌胃14 d。 　　2.2 模型制备及模型筛选 　　采用大脑中动脉栓塞法制备大鼠局灶性脑缺血/再灌注(focal cerebral ischemia/ reperfusion,FCIR)模型[5]。运用Zea-Longa的5 级4 分评分标准对模型进行筛选：0 分，正常，无神经功能缺损;1分，左前肢不能充分伸展，轻度神经功能缺损;2 分，行走时，大鼠向瘫痪侧(左侧)转圈，中度神经功能缺损; 3 分，行走时，大鼠身体向瘫痪侧(左侧)倾倒。重度神经功能缺损;4 分，不能自发行走，有意识丧失。模型只保留神经功能障碍在1 级以上的大鼠，不成功者剔除，补充动物，保证每组动物12 只。 　　2.3 标本采集及处理 　　灌胃后第15 d，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉并固定大鼠， 用200 mL 生理盐水经左心室快速灌注，至流出液变清，再用4%多聚甲醛缓慢灌注固定30 min，至肝脏变硬白后断头取脑，置于4%多聚甲醛固定4 h。石蜡切片机做冠状切片，片厚5 mu;m。 　　2.4 指标检测 　　2.4.1 神经功能评分神经功能评分参照Longa 5级4 分法，各组动物在手术完全清醒后和灌注后第15 天处死前2 h 进行评分。 　　2.4.2 免疫组化检测LN、TIMP1 和MMP9 表达具体步骤如下：切片脱蜡、水化组织切片;3% 双氧水孵育10 min 以阻断内源性过氧化物酶; 入PBS 修复液置微波炉修复抗原，PBS 冲洗，2 mintimes;3 次;滴加一抗LN、TIMP1 或MMP9 (均为1∶100)，4 ℃过夜;