3.NativePAGE的分类.pptVIP

4. 操作过程及注意事项 电泳 预电泳，除去凝胶中没有聚合的单体、双体和聚合引发剂，提高分辨率，30~60min。 电泳时候电压在100V~200V之间。过高则电泳时产生的热量太多导致蛋白变性；过低，延长电泳时间，电泳条带弥散。 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开。 4. 操作过程及注意事项 检测 染色：根据蛋白性质，所需灵敏度选用不同染色方法。常用： 考马斯亮蓝。灵敏度为0.2~0.5μg/带。G-250（蓝绿色），两步法：固定染色-脱色。 银染色。灵敏度为2ng/带。固定-显色。实验繁杂，费用昂贵。 荧光染料染色。5ng/带，显色无背景干扰 。难保存电泳结果。 透析袋电洗脱收集蛋白样品，与其他技术联用进行分析。 4. 操作过程及注意事项 保存 凝胶照片保存。 凝胶保存。 含7%醋酸溶液的密封塑料袋保存2-3个月。 干燥保存。 凝胶厚度1.0mm，用凝胶干燥仪干燥。 凝胶厚度1.0mm，自然干燥。 小结 随着蛋白质组学，金属蛋白质组学等概念的提出，越来越多的科学家致力于研究活性蛋白与蛋白之间相互作用，膜蛋白复合物，蛋白质三维结构和功能分析，Native由于其分离后仍能保持蛋白质的天然构象和功能的优势，必定会受到越来越广泛的应用。 谢谢大家! L/O/G/O Native PAGE China Pharmaceutical University 马海荣 S0930597 仇黎鹏 S0930598 李小文 S0930599 吴灿 S0930600 Contents 4 PAGE基本原理 1 2 3 Native PAGE Native PAGE 分类 实验操作过程及注意事项 1. PAGE 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺：acrylamide，简称Acr N,N-甲叉双丙烯酰胺：N,N—methylene-bisacylamide，简称Bis 1. PAGE 过硫酸铵：ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP。AP在水溶液中即可形成一个过硫酸自由基，化学聚合。 核黄素：riboflavin，即vitamin B2，C17H20O6N4。Riboflavin-TEMED系统需要光照和氧气，引起riboflavin分解生成自由基，称为光聚合。 N,N,N’,N’—四甲基乙二胺：N,N,N’,N’—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED 1. PAGE TEMED AP+H2O 过硫酸自由基 0-40℃ Bis PAM Acr 交联 聚合 三维网状结构 TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。 1. PAGE PAGE分离原理： 电荷效应：不同蛋白质所带电荷不同，在电场中迁移率不同。电荷越多，迁移越快。 分子筛效应：一定浓度的凝胶具有一定大小的孔径。分子量和形状不同的蛋白质泳动时所受到的阻滞程度不同，迁移率不同。 浓缩效应：不连续体系由电极缓冲液，浓缩胶和分离胶组成。浓缩胶和分离胶存在凝胶孔径的不连续性和缓冲系统（离子成分、pH和电位梯度）的不连续性。 1. PAGE PAGE类型 1. PAGE 2. Native PAGE 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native)是在不加入SDS、疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性和构象，对于生物大分子的鉴定有重要意义。 2. Native PAGE 影响native PAGE的因素 凝胶浓度：Acr的浓度改变范围为5%~10%，Acr:Bis可从20:1到50:1，引起不同筛分效应。 pH：一般采用pH为8.8，也可在微酸性环境下电泳，前提是不影响蛋白质的生物活性。 离子强度：过高，电泳时过度发热；过低，出现非特异蛋白凝集。范围通常在10~100mmol/L。 温度：所有步骤都要在0~4℃条件下进行，可保持蛋白质的活性，降低蛋白质的水解作用。 2. Native PAGE Na