第2次实验解说.doc

实验二 微生物的人工培养 一、培养基的制备及灭菌（讲解） （一）基本原理 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。 各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用高氏I号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基。另外还有固体、液体、加富、选择、鉴别等培养基之分。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在96℃以上熔化成液体，而在45℃左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。 培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的pH偏酸；细菌、放线菌的pH为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的pH值调到一定的范围。 1．牛肉膏蛋白胨培养基配方 牛肉膏 0.3 g 蛋白胨 1.0g NaCl 0.5g 水 100mL pH 7.4~7.6 2．高氏I号培养基配方 可溶性淀粉 2g NaCl 0.05g KNO3 0.1g K2HPO4·3H2O 0.05g MgSO4·7H2O 0.05g FeSO4·7H2O 0.001g 琼脂 1.5—2.5g 水 100mL pH 7.4~7.6 3．马铃薯培养基配方 马铃薯20g 葡萄糖2g 琼脂1.5~2.5g 水100ml 自然pH蔗糖3g NaNO3 0.2g K2HPO4 0.1g KCl 0.05g MgSO4·7H2O 0.05g FeSO4·7H2O 0.001g 琼脂1.5~2.5g 蒸馏水100ml （二）操作步骤 1．牛肉膏蛋白胨培养基配制方法 1）称量 图1 棉塞的制作棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使培养在里面的微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形应象一只蘑菇，大小、松紧都应适当。加塞时的棉塞的总长度的3/5应在口内，2/5在口外。配制方法配制方法配制方法马铃薯配制方法取去皮马铃薯200g，切成小块，1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底。用纱布过滤，葡萄糖加热煮沸后加入琼脂，继续加热融化并补足失水。分装、加塞、包扎0.1MPa灭菌20 min。配制方法配制 20小时金黄色葡萄球菌斜面培养物，20小时大肠埃希菌斜面培养物，24小时枯草芽孢杆菌斜面培养物，20小时混合细菌液体培养物（大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌） 营养肉汤琼脂斜面，营养肉汤培养基，半固体培养基，琼脂平板，无菌平皿，接种针，接种环，无菌移液管，记号笔，酒精灯。 （四）实验方法 以下所有操作均为无菌操作： 1．斜面接种 （示教） （1）取新鲜固体斜面培养基。分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两只试管中间。右手旋松棉塞，便于拔出；右手拿接种环，垂直于火焰中，环端及伸入试管中部分均充分灭菌；右手无名指、小指和手掌边夹住两试管棉塞，轻拔出，试管口过火后移开，仍靠近并面向火焰；将接种环伸入试管，稍冷后沾取少量菌体。 （2）将接种环引入待接种的斜面，自下而上在斜面上划一直线或曲线即可；取出接种环，将试管口再次过火后塞上棉塞，灼烧用过的接种环并放回原处。 （3）将棉塞塞紧，放入37℃恒温培养，培养24h后观察。 2．穿刺接种（示教） （1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），分别接入金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌。 （2） 接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种．然后从柱状培养基的中心穿入其底部(但不要穿透)、然后沿原刺入路线抽出接种针。注意接种针不要移动。 （3）接种后37℃恒温培养。24h后观察，比较两种菌的生长结果。 图1：斜面接种和穿刺接种 3．液体接种（示教） （1）以无菌操作挑取少许菌体引入待接种的液体培养基中，在接近液面处的试管壁上轻轻摩擦，适当摇动，使之均匀分布在液体中； 37℃恒温培养箱内培养24小时。 4．微生物的分离纯化——平板划线分离法（分小组操作） （1）准备好琼脂平板，并用记号笔标明培养基名称。 （2）划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取混合细菌液体培养物在平板上划线。划线