质粒DNA的小量制备.docVIP

质粒DNA的制备 实验原理： 质粒DNA为细胞核外小的环状双链DNA，在强碱作用下，核DNA与质粒DNA都会变形生成单链，当加入乙酸或乙酸钾时，在中性PH条件下只有质粒DNA会变性，而核酸DNA依然保持单链状态，再通过一系列抽提、离心即可得到纯化的DNA。 实验仪器与药品： 移液枪、离心机、EP管、水浴锅、电泳槽、枪头（10μl、200μl、300μl） 葡萄糖、Tris-Hcl（PH8.0）、EDTA（PH8.0）、NaOH、SDS、乙酸钾、醋酸、胰蛋白胨、酵母浸出物、NaCl 10×Buffer、dNTP、TaqE、Primer1、Primer2、Mg2+-Buffer、双蒸水、ECORI 实验步骤： 分别配置培养基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ备用，其成分如下： 培养基：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、NaCl10g 溶液Ⅰ：葡萄糖50mmol/L、Tris-Hcl（PH8.0）10 mmol/L、EDTA1 mmol/L 溶液Ⅱ（新鲜配置）：NaOH0.2mol/L、SDS1% 溶液Ⅲ：KAC29.4g、冰醋酸11.5ml、双蒸水28.5ml 将配制好的溶液与包装好的枪头盒一起放入高压灭菌锅中灭菌。 接种菌培养 取1.5ml培养物于EP管中，1300rpm离心1min集菌，去上清；再加入100μl预冷的溶液Ⅰ，振荡器剧烈振荡，使菌体悬浮，此时可看到EP管中变浑浊。 加入200μl现配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，可看到EP管中变澄清，迅速柔和颠倒数次以保证混合液与整个管内壁充分接触，冰浴3-5min。 加入150μl的溶液Ⅲ，温和颠倒数次以混合均匀，此时可看到EP管中有浆状沉淀，冰浴10min。 13000rpm离心10min，取400μl上清于另一EP管。 用1ml70%乙酸洗一次，1300rpm离心5min，弃上清，将离心管倒置，温室干燥5-10min。 用20-30μlTE溶解，-20℃保存。 分别用PCR和酶切的方法鉴定提取的质粒DNA。 PCR（50μl）：稀释50倍的质粒DNA 1μl、10×Buffer5μl、dNTP1μl、Primer11μl、Primer21μl、ddH2O38μl、Mg2+-Buffer2μl、TaqE1μl 酶切（10μl）：质粒DNA 1μl、ECORI0.5μl、10×Buffer1μl、 ddH2O7.5μl 加入到过程TaqE和ECORI需要后加，以保证酶的活性。 将取好的50μl溶液放入PCR仪中3h，10μl溶液置于37℃水浴锅中水浴。 将PCR产物，酶切产物分别电泳40min，在凝胶成像系统中观察实验结果。 实验结果： 1、PCR结果：可以观察到清晰的marker条带；第11加样孔，观察不到任何其他条带。如下图所示： 2、酶切结果：第11加样孔，观察在120—130bp附近有模糊条带，即为酶切目的片段，加样孔处很亮的为杂蛋白，100bp处很模糊的为RNA。如下图 结果分析： 可以观察到清晰的marker，但没有其他任何条带，说明问题不在电泳环节，问题应该在PCR反应过程中；质粒酶切得到结果，说明不是模板的问题；而所有组都没有得到目的片段，则排除操作上的原因； 综上，之所以没有得到目的片段，可能有以下原因 1、质粒反复冻融导致质粒DNA断裂 2、PCR退火温度太高，导致形不成双链质粒DNA 3、PCR体系太大，换成25微升的试试 4、PCR仪在反应过程中盖子没拧紧，导致模板挥发