研究生进修课程分子生物学.docVIP

核酸分子杂交（nucleic acid hybridization）指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则，形成异质双链的过程。 利用核酸分子杂交技术，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。 分子杂交基本原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下(适宜的温度及离子强度等)碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。 杂交的双方是待测核酸序列和已知核酸序列。在杂交体系中已知的核酸序列称作探针(probe)，探针通常用于进行核素或非核素示踪标记。用放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针（probe）。探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。 DNA变性的方法：1.加热，2.改变DNA溶液的PH，3.有机溶剂（如甲醛、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。 影响复性（杂交）速度的因素： 1、DNA浓度，2、DNA片段的大小， 3、温度。4、溶液的离子强度，5、DNA顺序的复杂性。 探针的种类极其选择：基因探针根据标记物不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类；根据探针的来源及核酸性质不同又可分为基因组DNA探针，RNA探针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。 指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。优点：①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位素和非同位素标记。RNA探针是一类很有前途的核酸探针，早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。 分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程 基因工程：利用分子克隆技术来操作目的基因，并改变生物的遗传性状的过程就称为基因工程。 分子克隆的基本过程：1.分：得到目的基因2.切：将目的基因和载体用适当的限制性内切酶切割。3.接：将目的基因和载体连接，形成重组子。4.转：将重组子转到适当的宿主细胞中。5.筛：筛选出含有正确重组子的宿主细胞，扩增。 工具酶分类 1. 使核酸降解的核酸酶类： 核酸内切酶、核酸外切酶。 2.催化核酸合成的酶类： DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶。 3. 核酸修饰酶类； 甲基化酶，激酶，基团转移酶， 磷酸酶等。 Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。 能以RNA为模板合成DNA的DNA聚合酶称为反转录酶(reverse transcriptase，RT)，合成的DNA产物称为互补DNA(complementary DNA，cDNA)。常用的逆转录酶有禽类成骨细胞性白血病病毒(AMV)逆转录酶和Moloney小鼠白血病病毒(mo·MLV)逆转录酶 所谓载体(vecter)是指能在连接酶作用下和外源DNA片段或基因连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子。目前用于基因克隆的载体种类繁多，包括在大肠杆菌中使用的质粒、噬菌体载体、酵母菌质粒载体以及动、植物病毒载体等 几种常用的DNA分子连接方法 ：1．粘性末端连接法2．平头末端连接法3．人工接头法4．同源多聚尾序连接法 质粒DNA分子或以质粒为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程称为转化(transformation)。 通过噬菌体的释放和感染将DNA从一个细胞转移到另一个细胞的过程称为转导(transduction)。 转染：是由转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动或被动导入外源DNA的过程。 要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将它放入带有基因表达所需要的各种元件的载体中，这种载体就称为表达载体（expression vector）。 原核生物基因大多具有操纵子模式，克隆基因表达需符合其调控特点。原核表达系统常用的强启动子。好的启动子必须具备的两个条件：一是转录效应强；二是可以被有效地控制。（1）Lac启动子，来自乳糖操纵子(Lac operon) （2）PL和PR启动子（3）trp启动，来自色氨酸操纵子（4）Tac启动子（5）T