【2017年整理】水溶性水溶性海星皂苷的分离纯化及其抗真菌活性研究.docVIP

水溶性海星皂苷的分离纯化及其抗真菌活性研究 何颖 北京化工大学北方学院 化药1107 摘要：为了分离纯化出具有强抗真茵活性的水溶性海星皂苷，以罗氏海盘车(Aster／as roUeston／)腕为实验材料，利用 水抽提方法获得水溶性海星皂苷粗品，依次利用大孔树脂和硅胶柱层析对水溶性海星皂苷进行了纯化，并对其抗 真茵活性进行了测定。研究结果发现，在30％、50％、70％、80％、95％乙醇溶液的大孔树脂柱层析洗脱组分中， 70％乙醇溶液洗脱组分对白色念珠茵和裂殖酵母菌的抗真菌活性最强。70％乙醇溶液洗脱组分经硅胶柱层析进 一步纯化后，得到了SF-1、SF-2、SF-3和SF-4四种纯化样品，其中SF-I纯化样品没有抗真菌活性，SF．2纯化样品具 有极弱的抗真茵活性，SF-3和SF-4纯化样品均具有很强的抗真菌活性。SF-3纯化样品在高压液相柱层析(HPLC) 图谱中仅显示单一洗脱峰，表明其纯度很高，可应用于高效抗真菌药物的研制。研究结果为利用水溶性海星皂苷 研制高效抗真菌药物奠定了基础。 关键词：海星；水溶性海星皂苷；抗真菌活性；大孔树脂柱层析；硅胶柱薄层层析 皂苷，又称皂甙，是一种广泛存在于植物以及海洋棘皮动物中的、具有多种药理学活性的物质。海星皂苷是海星的次生代谢产物，对纯的海星皂苷的大量试验表明它们具有多种药理活性：溶血活性、肿瘤细胞毒性、抗病毒作用、抗革兰氏阳性菌活性、阻断哺乳动物神经肌肉传导作用、Na+／K+．ATP酶抑制作用、抗溃疡作用以及抗炎、麻醉和降血压活性 等…。目前，对海星皂苷的制备多采用甲醇、乙醇等稀醇提取法协3J，这种工艺方法冗长复杂、萃取率低H】，存在着有机溶剂使用量大、成本高、容易对环境造成污染等一系列缺点∞1；同时提取的海星皂苷水溶性比较差，应用时常需用促溶剂如DMSO等对其进行溶解，这在一定程度上影响了其抗真菌活性，也限制了其在临床医学上的应用范围。到目前为止，国内外尚未见到对水溶性海星皂苷的报道极少，更没有利用水溶性海星皂苷进行抗真菌活性的研究报道。本文利用水抽提法、大孔树脂柱层析和硅胶柱层析从罗氏海盘车(Aster／as rollestoni)腕中分离并纯化出水溶性海星皂苷，筛选出具有显著抗真菌活性的水溶性海星皂苷单体，为利用水溶性海星皂苷开发研制高效抗真菌药物奠定基础。 1 材料与方法 1．1材料 罗氏海盘车(Asterias rollestoni)采自青岛胶州湾海域，裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)和白色念珠菌(Candida albicans)由中国海洋大学微生物工程实验室友情惠赠，采用YPD培养基(酵母浸膏O．5％，蛋白胨1％，葡萄糖2％，琼脂2％)于28 cc培养；旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂，冷冻干燥机购自美国西盟(SIM)公司，AB一8型大孔树脂购自天津南开化工厂，硅胶板及层析用硅胶(200～300目)购自青岛海洋化工厂，Agilentl 100型高压液相柱层析(HPLC)仪、RID检测器和Agilent ZORBAXEclipse XI)B．C18型HPLC层析柱(4．6 mm X 150 mm，0．5舯)为美国Agilent公司产品，HPLC层析柱洗脱流动相所用乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。 1．2水溶性海星皂苷的分离提取取 新鲜罗氏海盘车腕，用匀浆器打碎，60℃水浴2 h，期间不断搅拌，16层纱布过滤后收集海星水提液。将海星水提液pH调整为10，上样于预处理的AB．8型大孔树脂柱(30 mm×300 mm)，蒸馏水洗柱后分别用30％、50％、70％、80％、95％的乙醇溶液各300 mL进行洗脱，收集各种洗脱组分，石油醚脱脂后使用正丁醇进行萃取，经旋转蒸发和冷冻干燥后备用。 1．3大孔树脂各洗脱组分抗真菌活性测定 参照2005中国药典中的管碟法№3进行抑菌环直径的测定。将不同水溶性海星皂苷洗脱组分的冻干品配制成质量浓度为0．5 mg／mL的生理盐水溶液，分别测定其对裂殖酵母和白色念珠菌的抑菌环大小，测量抑菌环直径并拍照。 1．4水溶性海星皂苷的硅胶柱层析 将筛选出的具有高抗真菌活性的大孔树脂柱洗脱组分上样于硅胶常压柱(15 mm X 200 mm)，利用混合展层剂(‰丁醇：圪馥乙脂：‰=4：1：5)系统进行连续洗脱，收集洗脱组分(每管5 mL)。对各洗脱组分进行硅胶板薄层层析，合并迁移率相同的洗脱组分，经旋转蒸发和冷冻干燥后备用。 1．5水溶性海星皂苷各纯化组分的抗真菌活性测定 水溶性海星皂苷纯化组分抑菌环直径的测定方法同1．3。硅胶柱纯化样品的最低抑菌浓度(MIC)的测定参照丛日山等(20cr7)琼脂稀释法[5]。 1．6水溶性海星皂苷纯化样