【2017年整理】实验课-分子荧光光谱法实验报告.docVIP

实验二 分子荧光光谱法 [实验目的] 1、掌握荧光光度计的基本原理及使用。 2、了解荧光分光光度计的构造和各组成部分的作用； 3、掌握分子荧光光度计分析物质的特征荧光光谱：激发光谱、发射光谱的测定方法。 [实验原理] 1、激发光谱与发射光谱 具有不饱和基团的基态分子经光照后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态各振动能级所产生的光辐射。 激发光谱：是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长（或频率）变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。 荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱；获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以为纵坐标，为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱， 从曲线上找出，实际上选波长较长的高波长峰。 发射光谱：是指发光的能量按波长或频率的分布。通常实验测量的是发光的相对能量。发射光谱中，横坐标为波长（或频率），纵坐标为发光相对强度。发射光谱常分为带谱和线谱，有时也会出现既有带谱、又有线谱的情况。发射光谱的获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的不变，改变第二单色器波长，让不同波长的光扫描，测定它的发光强度，以为纵坐标，为横坐标得图谱即荧光物质的发射光谱，从曲线上找出最大的。 2、荧光分光光度计 包括四个部分，即激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。特殊点是有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器 光源：氙灯、高压汞灯、激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管 [仪器材料] 仪器：HORIBA Fluoromax-4荧光光谱仪 试剂：罗丹明B、2-萘酚、3,3-Diethyloxadicarbocyanine iodide（ HYPERLINK /ChemicalProductProperty_CN_CB7235551.htm 碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰花青）浓度分别为、、、、以及未知浓度试样一份。 [实验步骤] 1、按照实验原理中的方法分别扫描得到罗丹明B、2-萘酚和 HYPERLINK /ChemicalProductProperty_CN_CB7235551.htm 碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰化青（选取最高浓度的标准样品）的分子荧光光谱，确定三者各自的激发波长和发射波长。扫描确定未知溶液的和，根据图谱形状和激发、发射最大波长等信息确定未知溶液的物质种类。 2、在选定的激发波长和发射波长下，测定不同浓度 HYPERLINK /ChemicalProductProperty_CN_CB7235551.htm 碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰化青标准溶液的相对荧光强度。 3、以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标，绘制 HYPERLINK /ChemicalProductProperty_CN_CB7235551.htm 碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰化青的标准曲线。 4、依据 HYPERLINK /ChemicalProductProperty_CN_CB7235551.htm 碘化-3,3ˊ-二乙基氧杂二羰化青的标准曲线和未知溶液在和的相对荧光强度（由步骤1已确定为羰化青溶液）推算出其浓度。 图一 分子荧光分析仪基本部件示意图 [实验结果及分析] 图二1 罗丹明B激发光谱 图二2 罗丹明B荧光光谱 图三1 2-萘酚激发光谱 图三2 2-萘酚荧光光谱 图四 罗丹明B分子结构 图五 2-萘酚分子结构 发射光谱与激发光谱没有直接关系，发射光谱波长一般比激发光谱波长要长。从荧光光谱上可得出罗丹明B的，2-萘酚的。由于具有共轭体系的芳环或杂环化合物，p电子共轭程度越大，越易产生荧光；环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强。分析两种物质分子结构可知，罗丹明B共轭程度更大，因此荧光波长更长，与实验值相符合。 表一 标准曲线法实验数据 未知 40 30 20 10 14520 13440 11940 8640 4570 图六 标准曲线 （注：从曲线可以看出数据点（40，13440）严重偏离曲线，故舍去） 分析未知试样的激发