镍柱纯化原理及方法.docVIP

镍柱亲和层析 亲和层析的原理：利用分子间存在特异性的相互作用，它们之间都能够进行专一而又可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。 常见具有专一性亲和力的生物分子对： 酶： 基质类似物，抑制剂，辅酶 抗体： 抗原，病毒，细胞 细胞： 细胞表面特异蛋白，外源凝集素 核酸： 互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶 激素或药物： 受体，载体蛋白 外源凝集素： 多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞 文献将被固定在色谱基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。 配体以共价键结合到活化的基质上，构成固相载体。 一般载体采用琼脂糖凝胶、葡聚糖凝照、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素等。 咪唑环：是1，3二氮杂戊环，英文名是Imidazole,如果在第一位或第三位上的氮原子上去掉那个氢原子所剩余的部份，就叫咪唑基。就是咪唑上去掉一个和氮原子直接相连的氢原子后剩下的部分 组氨酸的性质：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。 金属离子：Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子可与N、S和O等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱氨酸（Cys）的巯基和色氨酸（Trp）的吲哚基发生亲和结合作用，其中以His的咪唑基的结合作用最强。过渡金属离子与咪唑基的结合强弱顺序是Cu2+＞Ni2+＞Zn2+≥Co2+ 。 镍离子：有六个螯合价位，通常将镍柱分为了Ni-NTA和Ni-IDA。Ni-NTA螯合了四价，剩余两价；而Ni-IDA螯合三价，剩余三价。因此Ni-IDA Agarose结合作用力要比Ni-NTA Agarose强，在同样条件下Ni-IDA Agarose的载量要比Ni-NTA 高，而且洗脱杂质和目标蛋白所用的缓冲液中咪唑浓度更高；但Ni-NTA 更稳定，耐受更强的还原剂，镍离子更不易脱落。因此需要根据不同的纯化条件选择纯化所需的镍柱，以达到纯化的最佳效果。 基质： ①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； ③抗微生物和酶的侵蚀； ④最好为粒径均一的球形粒子； ⑤具有亲水性，无非特异性吸附； ⑥含有可活化的反应基团，利于亲和配体的固定化。 例：琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。 配基：是可以可逆结合特定分子或特定基团的分子，能够通过亲和色谱的方式进行纯化。 配基的选择受到两种因素的影响：（1）：配基与目标物的结合必须具有特异性和可逆。 ：必须具有化学修饰基团，使它吸附在基质上，并且不损害它的活性。 间隔臂：目标蛋白质的结合位点位于分子中较深的部位，如果将配基直接偶联到基质上，受到空间位阻的影响，配基不能到达目标蛋白的结合位点，因此与目标蛋白的结合能力低。于是在配基与基质之间插入一个间隔臂可以使结合更加容易。间隔臂使结合最大化的同时要避免非特异性结合。 间隔臂的长度是关键，太短，无效; 太长，发生非特异性结合。一般规则：偶联的分子量小于1000时使用间隔臂；当大分子量，则不一定要。 二硫键：蛋白质的的二硫键在半胱氨酸残基的硫醇之间形成，包内蛋白离开细胞后，二硫键常以氧化状态存在。 此键在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。为了确定蛋白质的一级结构，首先必须将二硫键打开，使成为线状多肽链。 上样方式：（1）直接上样 （2）间接上样 洗脱方式：（1）pH值洗脱：pH的改变可以改变带电荷的配基基团和结合蛋白的离子化程度，使它们结合位点的亲和性降低。（降低pH的方法） （2)离子强度洗脱： (3)竞争性洗脱：（咪唑） 再生：(1)先用强变性剂6M盐酸胍冲洗柱子 用水冲洗干净 0.2%SDS冲洗柱子 用水冲洗干净 50%乙醇冲洗柱子 用水冲洗干净 用100mM EDTA(50mM Tris 100mM EDTA PH 8.0)冲洗柱子 用水冲洗干净 用100mM 硫酸镍孵育柱子 20%乙醇中4℃保存 上清缓冲液及配方 上清纯化缓冲液 配方 Lysis Buffer 50mM Tris-HCl；150mM NaCl；20mM Imidazole；pH8.0； Elution Buffer 1 50mM Tris-HCl；150mM NaCl；50mM Imidazole；pH8.0； Elution Buffer 2 50mM Tris-HCl；150mM NaCl；100mM Imidazole；pH8.0； Elution