HSP70在香烟诱导气道粘液高分泌机制_培训课件.pptVIP

HSP70在香烟诱导气道MUC5AC表达的作用及其机制研究 研究生：张明周  内容 前 言 研究背景 我国烟草产量相当于世界第2大香烟生产国美国的4倍，有烟民3.2亿，是世界吸烟总人数的1/4。 吸烟是诱发和加重多种呼吸系统疾病的重要原因之一。吸 烟所致的气道粘液高分泌可以加速患者肺功能的进一步下 降，使患者病情恶化频率及死亡的危险性增高。 研究背景 据中国疾病监测系统的报告：每年吸烟引起相关疾病在我国造成60万人死亡；以目前的吸烟的严峻形势预测，现在29岁以下的3亿男性中，有1亿人将因吸烟而过早死亡，其中半数死于中年。 吸烟相关呼吸系统疾病的致残 率之高也相当惊人。 研究背景 气道黏液高分泌是多种呼吸道慢性炎症疾病如慢性支 气管炎、支气管哮喘、支气管扩张和肺囊性纤维化等的 重要特征。 在慢性炎症状态下，黏蛋白分泌异常、呼吸道腔内黏 液纤毛清除功能障碍，导致呼吸道细菌定植、黏液栓形 成、气体交换障碍等。 研究背景 热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一组由生物 细胞(包括原核细胞及真核细胞)在应激原刺激后，发生热 休克反应时所产生的一类细胞蛋白。HSP70是其中重要的 一种。 HSP70有多种生物活性作用，例如分子伴侣作用、抗凋亡、 抗氧化等作用。 研究背景 目前有关HSP70与粘液高分泌的作用研究集中在与富含丙 氨酸的豆蔻酰化的激酶C底物（MARCKS）参与粘蛋白分泌 过程。 根据上述研究结果我们假设HSP70可能通过某些其他途径 不仅参与了粘蛋白的分泌，而且合成的过程。 研究背景 实验原理（一） HSP70蛋白氨基端具有弱的ATPase活性，在给予相应的 单抗抑制其N 端ATP酶的功能后，HSP70的生物学活性 丧失。实验拟通过HSP70单抗阻断HSP70生物活性，探 讨HSP70在粘液高分泌中的作用及其机制。 研究背景 实验原理（二） 香烟提取物（cigarette smoking extraction CSE）是香 烟烟雾的溶解液，含有香烟烟雾的主要成分，可作为香烟 替代物用于细胞烟熏刺激的研究。 研究背景 利用CSE的上述特性，实验通过CSE干预气道上皮细胞， 作为粘液高分泌模型的干预刺激因素。 材料与方法 材料与方法 材料与方法 鼠抗人HSP70抗体 引物探针（HSP70、β-actin） 引物探针（MUC5AC、TNF-α） 五牛牌香烟（焦油含量：16mg，烟气烟碱量：1.2mg ） 鼠二抗 β-actin抗体 蛋白质分子量maker PVDF膜 X光片 Phospho-EGFR鼠抗人抗体 HSP70兔抗人单抗 RT-PCR试剂盒 western blot检测试剂盒 DMEM培养基细胞培养瓶 材料与方法 100%CSE母液 DMEM培养基 PBS western bolt running buffer 4×stacking buffer 4×seperating buffer 10%SDS-聚丙烯酰胺分离胶 15%SDS-聚丙烯酰胺基层胶 cathode buffer Anode buffer 10×TBS TBST 50×TAE 材料与方法 2.主要仪器 生物安全柜 PTC-200DNA ENGine PCR扩增仪 Eppendorf Centrifuge 5415D 制胶器及垂直平板电泳仪 电转仪 核酸蛋白定量仪 水平电泳仪 JD200-3型光学显微镜 Quantity One图像分析软件 SK-1快速匀浆仪 HB2460 超净工作台Gel Doc 1000 凝胶成像系统 温控高速离心机 Bio-RAD 680蛋白定量仪 KA-1000型台式低速离心机 二氧化碳培养箱MCO-175AI 实验方法 实验步骤： 实验方法 1.CSE干预下HBE细胞模型制作 1.1细胞复苏和培养 实验方法 1.2 细胞传代培养 实验方法 1.3 细胞CSE干预 取对数生长期的HBE细胞，采用上述传代方法接种于培养 皿中，37℃、5％CO2，孵箱中培养，待细胞生长单层融合 后，予以无血清培养基饥饿使细胞同步化后采取下述方法 干预： 实验方法 1.3.1药物干预浓度梯度： 以前述方法配制的CSE作为100%母液预先用DMEM稀释至设置 浓度后加入下列各组细胞。在孵箱中培养24h后观察、检测。 实验方法 1.3.2药物干预时间梯度： 设置各时间组，以CSE8%作为干预浓度，同上述方法干 预，分别于相应时间收集标本观察、检测。 实验方法 MTT实验 实