第3章生化(刘建华).ppt

蛋白质氨基酸组成分析 6N HCl，110oC加热24小时 用离子交换层析分离氨基酸，根据出峰体积确定各氨基酸组分（图3.16）。 除了脯氨酸外，用茚三酮处理氨基酸产生深蓝色（但脯氨酸显黄色)。茚三酮衍生物的光吸收与氨基酸浓度成正比（氨基酸检测极限：1微克或10 nmol，相当于一个指纹的氨基酸含量）。用荧光胺代替茚三酮更灵敏，低至一奈克（10 pmol）的氨基酸也可以测出。 洗涤采用pH值逐渐增加的柠檬酸钠溶液。 荧光胺 茚三酮 Figure 3.18. The Edman Degradation. The labeled amino-terminal residue (PTH-alanine in the first round) can be released without hydrolyzing the rest of the peptide. Three more rounds of the Edman degradation reveal the complete sequence of the original peptide. Figure 3.19. Separation of PTH-Amino Acids. PTH-amino acids can be rapidly separated by HPLC. In this HPLC profile, a mixture of PTH-amino acids is clearly resolved into its components. An unknown amino acid can be identified by its elution position relative to the known ones. Edman降解的长度不能超过50氨基酸。 CNBr断裂多肽链的位点：Met-X Trypsin断裂多肽链的位点：Lys-X Arg-X 图3.22 重叠肽段。基于胰凝乳蛋白酶酶切后的肽段与胰蛋白酶酶切后的肽段序列重叠，构建肽段排列顺序。 二硫键交联多肽链的分离： （1）用还原试剂如b-巯基乙醇或DTT处理。 （2）然后用碘代乙酸处理将巯基烷基化形成稳定的S-羧甲基衍生物，能够阻止半胱氨酸重新氧化形成二硫键（图3.23）。 对角线电泳技术 (diagonal electrophoresis) ：确定蛋白质的二硫键位置。第一步在二硫键保持完整的条件下裂解蛋白质。将裂解混合物上样到点用用滤纸的一个角落，沿一个方向电泳。第二步将滤纸置于过甲酸蒸汽环境中，二硫键发生断裂生成磺酸类半胱氨酸。采用同样的条件，在垂直方向电泳。 确定二硫键位置 蛋白质氨基酸序列用途 了解蛋白质结构与功能。氨基酸序列与序列已知蛋白质进行比较，寻找序列相似性，确定该蛋白质的家族属性。推测该蛋白质的结构与功能。 研究蛋白质进化。与不同物种的同一蛋白进行序列比较，找出该蛋白质的进化关系。 搜寻内部的序列重复。搜寻蛋白质内部有无重复序列。内部重复能揭示蛋白质本身的进化史。很多蛋白质是原型基因重复后差异化的结果。 了解定位信号的有无。 作为抗原制备抗体。 基因探针。 Figure 3.25. Repeating Motifs in a Protein Chain. Calmodulin, a calcium sensor, contains four similar units in a single polypeptide chain shown in red, yellow, blue, and orange. Each unit binds a calcium ion (shown in green). 重组DNA技术极大地促进蛋白质序列测定。 Figure 3.27. Antibody Structure. (A) IgG antibodies consist of four chains, two heavy chains (blue) and two light chains (red), linked by disulfide bonds. The heavy and light chains come together to form Fab domains, which have the antigen-binding sites at the ends. The two heavy chains form the Fc domain. The Fab domains are linked to the Fc domain by flexible