生物工程下游技术 第三章 微生物细胞的破碎.pptVIP

微生物细胞的破碎 * * 为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）： 多聚糖 （80-90%） 脂类 蛋白质 葡聚糖 （30-40%） 甘露聚糖 （30%） 蛋白质 （6-8%） 脂类 （8.5-13.5%） 肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质 肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%） 主要组成 多层 多层 多层 单层 层次 100-250 100-300 10-13 20-80 壁厚/nm 霉菌 酵母菌 革兰氏阴性细菌 革兰氏阳性细菌 微生物 一、细胞壁的组成和结构 细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固； 酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度； 由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。 二、常用破碎方法 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活 改变细胞膜渗透性 干燥法 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物 反复冻结-融化 冻结融化法 破碎率较低，常与其他方法结合使用 渗透压剧烈改变 渗透压法 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差 改变细胞膜的渗透性 化学渗透法 具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差 酶分解作用 酶溶法 非 机 械 法 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目的产物不适合 固体剪切作用 X-press法 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作 液体剪切作用 超声破碎法 可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌 液体剪切作用 高压匀浆法 可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难 固体剪切作用 珠磨法 机 械 法 适 应 性 作 用 机 理 分 类 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。 1.珠磨法（Bead mill） 原理： 实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。 采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。 2.高压匀浆法（High-pressure homogenization） ——大规模细胞破碎的常用方法 利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。 原理： 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。 易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀） 不宜采用高压匀浆法。 在15-25 kHz的频率下操作。其原理可能与空化现象（cavitation phenomena）引起的冲击波和剪切作用有关。 空穴泡由于受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞液体发生流动，从而使细胞破碎。 3.超声破碎法（Ultrasonication） 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差， 该法在实验室小规模细胞破碎中常用。 但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。 4.酶溶法（Enzymatic Lysis） （1）外加酶法 常用的溶酶 溶菌酶、 β-1，3-葡聚糖酶、 β-1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等 溶菌酶主要用于细菌类 细胞壁溶解酶是几种酶的复合物 对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。 利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学