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Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system 前言 CRISPR-Cas9 发展历史 CRISPR-Cas9 结构，作用机制 CRISPR-Cas9 的构建 CRISPR-Cas9 的应用 前言 自2012年以来，研究人员常用一种叫做CRISPR的强大“基因组编辑”技术对生物的DNA序列进行修剪、切断、替换或添加。最近，美国约翰·霍普金斯大学医学院的科学家证明，这一系统还能精确有效地改变人类的干细胞。研究人员指出，这一发现简化了对诱导多能干细胞（iPSCs）的修改和定制，有望更快在治疗上取得成果，开发出用于疾病研究和药物测试的模型系统。相关论文在线发表于最近的《分子治疗》上。 CRISPR来自微生物的免疫系统，这种工程编辑系统利用一种酶，能把一段作为引导工具的小RNA切入DNA，就能在此处切断或做其他改变。以往研究表明，通过这些介入，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，效率比TALEN（转录激活因子类感受器核酸酶）等其他基因编辑技术更高。但最近研究发现，虽然CRISPR有许多优点，在人类癌细胞系列中，它也可能产生大量“误伤目标”，尤其是对不希望改变的基因做修改。 近年来随着人类基因组测序的完成和全基因组测序技术的不断发展，复杂基因组中未知基因功能的探索对生物学的定点研究、临床医学及基因治疗都有着不可替代的作用。长期以来，基于同源重组机制的基因敲除技术已在基因功能研究中被广泛采用，但是该技术在实际工作中存在着效率太低、费时费力，而且有可能导致基因突变等问题，使基因功能的研究变得困难。随着生物技术的发展，基因组编辑技术经历了三代技术的发展：即锌指核酸酶 (zinc fingernucleases，ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effe-cor nucleases，TALEN) 和规律性重复短回文序列簇与Cas9蛋白(clustered regularly intersp-aced short palindromicrepeats，CRISPR/Cas9)。 Cas9：基因组编辑中RNA指导的核酸酶 Cas核酸酶类型介绍 TypeⅠ系统是CRISPR/Cas 系统中Cas 蛋白最多和最复杂的系统，包含6 个蛋白，其中有特征性的Cas3 蛋白，该蛋白具有解旋酶和核酸酶功能． 多个Cas 蛋白与成熟的crRNA 共同结合形成CRISPR 相关病毒防御复合物CASCAD(CRISPRassociated complex for antivirus defense)，CASCAD与入侵的外源DNA 结合， 促使CASCAD 内的crRNA 与外源DNA 的互补链配对形成R 环结构，Cas3 的核酸酶识别R 环结构后先将互补链切开，随后在Cas3 的解旋酶和核酸酶作用下再将非互补链切开． Cas核酸酶类型介绍 II型CRISPR系统是最具有特色的系统之一，包括Cas9 核酸酶，编码导向RNA的crRNA序列及必须的辅助转录激活crRNA（tracrRNA），tracrRNA负责促进crRNA序列加工成小片段。每个crRNA单元都包含一个20nt的引导序列和一个部分正向重复序列，前者指导Cas9通过碱基互补配对与20bp的靶DNA配对。CRIEPR-Cas系统源自化脓链球菌（在该草案中使用的系统），靶DNA必须直接在5’-NGG PAM之前，然而其他的Cas9 同系物可能含有不同的PAM需求，例如：嗜热链球菌（对于CRISPR 1 的5′-NNAGAA和 CRISPR 3 的5′-NGGNG）和脑膜炎双球菌（(5′-NNNNGATT）。 Cas核酸酶类型介绍 Type Ⅲ系统包含特征性的Cas10 蛋白，其具有RNA 酶活性和类似于Type Ⅰ 的CASCAD 功能．Cas10 主要参与crRNA 的成熟和剪切入侵外源DNA．目前发现TypeⅢ有两种亚型：TypeⅢ A和TypeⅢ B．激烈热球菌的CRISPR/Cas 系统属于TypeⅢ A 型，它干扰的靶标是mRNA；葡萄球菌CRISPR/Cas 系统属于TypeⅢ B 型，它的靶标与Type Ⅰ 和Ⅱ CRISPR/Cas 系统相同， 是DNA．这也反映了自然界中的CRISPR/Cas 系统的多态性． Cas9利用HNH和RuvC核酸酶结构域进行链特异性切裂，这可以用于额外功能的改变和开发。RuvC催化结构域天冬氨酸盐-丙氨酸（D10A）突变使得Cas9切口酶突变体（Cas9n）切开DNA来获得单列DNA碎片，而不是裂开DNA，随后的HDR择优修复可以减少脱靶时不需要的插入突变的发生几率。适当的抵消成对的sgRNA可以引导Cas9n同时切开DNA两条链上的靶位