闽江河口芦苇湿地硫酸盐还原菌的多样性研究..docVIP

闽江河口芦苇沼泽湿地硫酸盐还原菌的多样性研究 【摘 要】为了深入揭示闽江河口芦苇湿地的硫元素代谢循环，采用PCR-RFLP技术对芦苇湿地土壤表层的硫酸盐还原菌多样性进行了研究。在构建的克隆文库中，随机挑取100个克隆进行菌落PCR验证，共得到97个阳性克隆,阳性率为97%。阳性克隆的PCR产物利用限制性内切酶进行酶切分析。结果表明，闽江河口芦苇湿地土壤表层的硫酸盐还原菌经RFLP分析可得到20个不同的分类操作单元(OTUs),其中以OTU-2（11）、OTU -3（23）、和OTU -19（19）为主。Shannon多样性指数（H ′）和Simpson多样性指教（D）计算结果显示，土壤表层（0—10 cm）的Shannon指数（H′）为2.49，Simpson多样性指教（D）为0.114。 【关键词】硫酸盐还原菌；多样性；PCR-RFLP；芦苇湿地 1．引言（查文献进行修改）1000字 通过对闽江河口芦苇沼泽湿地硫酸盐还原菌的多样性研究，闽江沿岸芦苇湿地土壤呼吸的昼夜变化和季节变化进行测量,结果表明:在最高水位土壤表面未淹水的状态下,不同季节的土壤呼吸日动态没有一致的规律性,土壤温度和土壤体积含水量不是土壤呼吸日变化的主要影响因子;而在最高水位土壤表面淹水的状态下,水位对土壤呼吸强度有一定影响:当土壤表面被淹没时,土壤呼吸强度约为0;当水位下降时,土壤呼吸强度增加.土壤呼吸的季节变化呈单峰形式,5 cm处土壤温度仅能解释土壤呼吸季节变化的49.4%,而土壤体积含水量对土壤呼吸季节变化无显著影响.? 有关湿地硫循环的相关研究进展(补充) 有关硫酸盐还原菌的研究进展,特别是湿地土壤中硫酸盐还原菌的相关研究进展(补充) 本研究从闽江河口芦苇湿地土壤中提取微生物宏基因组DNA，利用DSR引物用于扩增硫酸盐还原菌的dsrAB基因，利用胶回收试剂盒进行dsrAB基因基因的回收及纯化，同时构建克隆文库，进行RFLP分析，为进一步研究河口湿地土壤硫酸盐还原菌多样性提供理论基础。 2．材料与方法 2.1　主要仪器和试剂 2.1.1 主要仪器： PCR扩增仪、自动凝胶成像分析仪、冷冻高速离心机、台式高速离心机、核酸电泳仪、涡旋混合仪、低温冰箱、高压蒸气灭菌锅、超微量紫外分光光度测定仪、超净工作台、恒温震荡揺床、恒温震荡揺床、移液枪等。 2.1.2 主要试剂： 土壤DNA提取试剂盒、琼脂糖、Tag DNA聚合酶、EB、200bpDNA Ladder 、50bpDNA Ladder 、Promega 胶回收试剂盒、LB液体及固体培养基等，以上生化试剂大多为分析纯。 2.2 土壤总DNA的提取 准确称取0.25 g土壤采用土壤DNA提取试剂盒（MO BIO Laboratories, USA），按厂家操作说明书的方法进行土壤总DNA的提取和纯化。DNA纯度和浓度通过紫外分光光度计 (NanoDrop, USA)进行检测，收集的DNA样品在分析和PCR扩增之前存于－20 ℃备用。 2.3 dsrAB基因的扩增及纯化 以提取的土壤总DNA为模板用于扩增大约1900 bp的dsrAB基因片段，扩增引物采用硫酸还原菌的特异性引物DSR1F：（5’-AC[C/ G]CACTGGAAGCACG-3’）和DSR4R：（5’-GTGTAGCAGTTACCGCA-3’）[134]。PCR反应体系为50 μL：10×PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，引物各1 μL，0.5 μL rTaq酶，DNA模板1 μL，加灭菌的ddH2O至50 μL。 PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 S，58 ℃退火45 S，72 ℃延伸2.5 min，33个循环；最后72 ℃延伸7 min。扩增的PCR反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外灯下切下含目的DNA片断的凝胶条带，用琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒（Promega，USA），按厂家说明书的方法进行dsrAB基因的回收纯化。 2.4 dsrAB基因克隆文库的构建 纯化后的dsrAB基因片段按厂家说明书的方法与pMD 18-T vector（Takara，大连）连接。连接体系为：pMD 18-Tvector 1 μL，目的基因2 μL，灭菌的ddH2O 2 μL，Solution I 5 μL，总体积10 μL。16 ℃过夜连接后，转化入E. coli DH5α感受态细胞。转化产物涂布到含有氨苄青霉素(Ampicillin)/IPTG/X-Gal的LB固体培养基上，37 ℃下培养16-24 h，通过蓝白斑筛选方法筛选重组子，白色克隆子即为阳性转化子。挑取阳性转化子构建克隆文库，克隆文库用LB（Amp+）平板4 ℃保藏。 2.5 dsrAB基因克