精选课件核酸的提取分离.ppt

生化工艺学课件第五章 核酸的提取分离 第五章 核酸的提取分离 §5.1 概述 §5.2 核酸的理化性质 §5.3 核酸的作用与用途 §5.4 动物脏器核酸的提取分离方法 §5.5 转移因子的制备 §5.6 辅酶A的提取 §5.7 复合辅酶的提取 §5.8 从啤酒酵母中提取RNA §5.1 概述 核 酸（nucleic acid) 核苷酸(nucleotide) 磷酸 (phosphoric acid) 核苷(nucleoside) 戊糖(pentose) 碱基(base) 组成核苷酸的碱基 Fig. 2-4 The primary structure of DNA. 脱氧核糖核酸（DNA）主要存在于细胞核的染色体中，核糖核酸（RNA）主要存在于细胞的微粒体中，各种生物体含有核酸的多少不同 应用于临床的核酸及其衍生物类生化产品越来越多 我国人工合成丙氨酸转移核糖核酸，76个核苷酸，与天然酵母丙氨酸核糖核酸具有相同的化学结构，有接受丙氨酸、将携带的丙氨酸掺入到蛋白质中的生物活力 呈味核苷酸是目前国际上流行的新型鲜味剂，其学名为5－IMP（肌苷酸钠）、5－GMP（鸟苷酸钠）、I＋G（50％IMP＋50GMP）， 我国第三代鲜味剂鸡精的特点为：由鸡肉、鸡蛋、呈味核苷酸、水解蛋白粉、味精及多种调味料复合而成。 核酸类的药物主要是核苷酸、嘌呤及嘧啶类相关的衍生物 保健品：某核酸公司宣称其产品具有增强基因自主修复能力，还能改善微循环、改善脑机能；促进新陈代谢、抗疲劳；提高免疫力；活化皮肤细胞、润肤美容。 核酸在食品和药品领域中的应用 ？ 核酸工业的市场分析 核酸药物产品的开发已有近70年历史。目前，日本是核酸产品的最大生产国，其年产量约7500吨，约占世界产量的90%；西方国家中，意大利也有核酸产品，但产量不是很大。近年来，韩国核酸产业兴起，主要为调味品。 我国核酸产品的研究开发起步较早，并取得了令人瞩目的成就。然而目前我国核酸药物产品主要依靠进口，仅ATP一项每年就从日本进口金额达八千万美元 §5.2 核酸的理化性质 §5.2.1 核酸的一般性质 1、DNA分子与蛋白质分子、RNA相对分子质量？ 2、DNA白色纤维状固体，RNA白色粉末，均微溶于水，稀碱溶液中成盐后易溶于水，不溶于有机溶剂，但可溶于乙醇的水溶液，乙醇＞50％（w/w）时，DNA析出，当＞75％时，RNA也沉淀出来 →溶解度差别分离 ≥106 几千到百万 几万到几百万 盐溶液中溶解度差异 提取RNA时NaCl盐溶液浓度仅为0.14mol/L即可 而提取DNA时，需先用0.14mol/L NaCl将RNA除掉，再继续增加NaCl浓度至1mol/L时才能够将DNA提取出来 §5.2.1 核酸的一般性质 3、DNA极稀的溶液黏度极大，变性时黏度降低，pH超出5.6-10.9时，相对黏度突然降低 4、可被酸、碱或酶水解成各种组分，用层析、电泳等方法分离，主要利用： RNA的磷酸酯键对碱敏感：室温，0.3~1mol/L KOH，24h，可将RNA完全水解，得到2’-或3’-核苷酸的混合物。 ★DNA抗碱水解 ★生理意义： DNA更稳定 ，遗传信息。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。 §5.2.2 核酸的紫外吸收性质 嘌呤、嘧啶环→共轭双键→紫外吸收，核酸λmax 260nm附近，而λmin 230nm 1、鉴定纯度 纯DNA的A260/A280≥1.8； 纯RNA的A260/A280 ≥ 2.0 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280↓ 2、 含量计算，吸光值为1.00时，相当于： 50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸 DNA和RNA均在紫外光下有最高吸收峰，可采用OD260nm测定其浓度 另一方面DNA和RNA含磷含糖，所以可通过糖含量及磷含量的测定方法间接表征核酸的含量 RNA所含糖为核糖→苔黑酚法测定； DNA所含糖为脱氧核糖→二苯胺法测定。 含磷量测定时均需先经过消化将有机磷转变为无机磷才能测定，纯RNA含磷量为9％，而纯DNA含磷量为9.2%。 §5.2.3 核酸的变性和复性 高温（热变性）、酸碱（pH小于4或大于11）及某些变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）能破坏核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。 变性后的理化性质 ★DNA的变性是爆发式的，变性 作用发生在一个很窄的温度范围内。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。 260nm吸收值升高。 ★?? 增色效应与减色效应 增色效应：在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大 减色效应：在DNA的复性过程中，摩尔吸