醋酸纤维素薄膜电泳幻灯片.pptVIP

实验目的 1．掌握电泳的基本原理，了解电泳仪和电泳槽的功能。 2．熟悉电泳的基本过程与操作方法。 电泳 实验原理 优点: 快速、准确、重现性好。 应用: 1. 分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等； 2. 分析某种物质的纯度及分子量。 对生物大分子而言： 电场力: F = QE 阻力: F’ = 6πrηυ 当电泳达到平衡时，带电颗粒匀速运动: F = F’ QE = 6πrην 迁移率: 即ν/E，表示单位电场强度时粒子运动的速度。 该值在一定条件下决定于粒子本身的性质，即其所带电荷、大小和形状. 6πrη Q E = ν 影响电泳速度的因素 样品本身：带电量、分子大小、形状 电场强度：电压 缓冲液：成分、pH、离子强度(0.02-0.2 M) 支持介质：电渗作用、吸附作用 温度 负极 正极 － － － － － － － －－ － － － － － － － 表面带负电荷 带正电荷的水层携带粒子向负极移动 如果样品应移向负极，则泳动速度加快； 如果样品应移向正极，则泳动速度减慢。 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ 显微电泳 等电聚焦电泳 等速电泳 密度梯度电泳 电泳 自由电泳 (无支持体) 区带电泳 (有支持体) 滤纸电泳(常压及高压) 薄层电泳(薄膜及薄板) 凝胶电泳(琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺) 分类 水平电泳槽 垂直板电泳槽 圆盘电泳槽 双向电泳 醋酸纤维薄膜电泳 醋酸纤维素薄膜电泳以醋酸纤维素薄膜为支持物。 1. 样品吸附极少，无拖尾现象，条带清晰。 2. 快速省时。 3. 灵敏度高，样品用量少。 4. 制成透明干膜用于定量扫描分析与长期保存。 5. 操作简单、快速、价廉. 醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，将其溶于丙酮等有机溶液中，可涂布成均一细密的微孔薄膜。待有机溶剂挥发后，即为白色不透明的醋酸纤维薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120μm，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。 染色方法 氨基黑10B 考马斯亮蓝R250 银染色法 考马斯亮蓝R250 考马斯亮蓝G250 人血浆蛋白质的等电点及迁移率 蛋白质名称 等电点 泳动度/(cm2·V-1·S-1) 分子量 白蛋白 4.88 -5.9×10-5 69,000 α1-球蛋白 5.06 –5.1×10-5 200,000 α2-球蛋白 5.06 –4.1×10-5 300,000 β-球蛋白 5.12 -2.8×10-5 9,000-150,000 γ-球蛋白 6.85-7.50 -1.0×10-5 156,000-300,000 病名 白蛋白 α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白 肾病 ↓↓ ↑ ↑↑ ↑ ↓ 弥温性肝损害 ↓↓ ↑ ↓ ↓ ↑ 肝硬化 ↓↓ ↓ ↓ β-γ桥 原发性肝癌 ↓↓ AFP ↑ 多发性骨髓瘤 ↑ ↑↑ 慢性炎症 ↓ ↑ ↑ ↑ 妊娠 ↓ ↑ ↓ 无丙种球蛋白血症 ↓↓ 双白蛋白血症 双峰 实验器材和试剂 实验器材 电泳槽、电泳仪、染缸、滤纸、醋酸纤维素薄膜、点样器 试剂 1. 血清 2. 巴比妥-巴比妥钠缓冲液 (pH 8.6、I = 0.06) 3. 染色液: 氨基黑10B 0.25g，甲醇50 mL + 冰醋酸10 mL + 水40 mL溶解 (可重复使用) 4. 漂洗液：甲醇45 mL + 冰醋酸5 mL + 蒸馏水50 mL 实验步骤 1. 点样面为不光滑面，勿用手触摸； 2. 点样量适中，垂直居中点样； 3. 点样端靠近电泳仪负极； 4. 膜条背面朝上放置，需与滤纸贴紧，拉直。 注意事项 思考题 分析影响电泳的各个因素。 分析自己的实验结果，针对本实验的各项操作提出改进意见。 * * *