EB病毒转化淋巴母细胞及诱发瘤中LMP基因的表达.docVIP

EB病毒转化淋巴母细胞及诱发瘤中LMP基因的表达 　　摘要：目的 了解EB病毒在正常人淋巴细胞、体外培养的EBV转化的淋巴母细胞及诱发的淋巴瘤细胞三种细胞中LMP的表达情况及表达差异。方法 采用实时定量PCR方法检测LMP基因在三种细胞中的表达改变。采用Western bolt检测LMP-1蛋白表达。结果 实时定量PCR检测LMP基因在三种细胞中均有表达。同正常细胞相比，LMP-1、LMP-2A、LMP-2B在转化细胞中表达上调，在诱发瘤细胞中表达也上调，且这三个基因在转化母细胞中表达的上调幅度均大于其在诱发瘤中的表达。结论 EB病毒在体内和体外可能通过不同的方式诱导细胞突变，促进肿瘤的发生。 　　关键词：EB病毒；转化淋巴母细胞；病毒基因；LMP-1；LMP-2A；LMP-2B 　　中图分类号：R36，R733 文献标识码：A 　　目前已知的EB病毒基表达产物潜伏膜蛋白（latent membrane protein LMP）包括LMP-1、LMP-2A和LMP-2B。LMP-1通常被认为是病毒致癌基因，在肿瘤的形成过程中起着积极作用[1]。在EBV相关恶性肿瘤中能持续检测到LMP-2A转录物，提示LMP-2A对体内病毒持续感染可能有重要作用。在EBV转化淋巴母细胞中及诱发瘤细胞中，LMP基因表达情况目前尚未见报道，因此本实验通过对EB病毒转化淋巴母细胞和诱发淋巴瘤中LMP-1、LMP-2A、LMP-2B的表达进行检测，分析在EBV转化淋巴细胞及诱发淋巴瘤过程中LMP可能起重要作用。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 B95-8细胞由中南大学湘雅医学院肿瘤研究所馈赠。严重联合免疫缺陷动物SCID-Beige小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；逆转录试剂盒购自Promage公司；SYBR○RPremix Ex TaqTM试剂盒购自Takara公司。 　　1.2方法 　　1.2.1 EB病毒转化淋巴母细胞的培养 培养B-958细胞提取EB病毒。分别从7名健康献血员取外周静脉血3 ml，分离血液中的正常人淋巴细胞。18 d左右即可建立稳定生长的淋巴母细胞系。 　　1.2.2复制SCID小鼠体内诱发淋巴瘤的动物模型 构建PBL/SCID嵌合体小鼠模型[2]，获得诱发淋巴瘤后病理学检查免疫组织化学法检测确诊肿瘤，并确认诱发瘤的类型 　　1.2.3实时定量PCR及实时定量PCR结果计算并western blot 检测LMP的表达 分别提取正常人人淋巴细胞，对数生长期的转化淋巴母细胞，诱发瘤细胞的总RNA并纯化，合成cDNA按试剂盒说明书步奏做实时定量PCR并计算其结果 　　1.3统计学处理 实验所得所有数据采用（x±s）表示，转化淋巴细胞、诱发瘤细胞间比较采用t检验，以P0.05 为差异有统计学意义。 　　2结果 　　2.1体外EB病毒转化的永生化淋巴细胞 倒置显微镜下，转化淋巴细胞呈圆形，部分细胞呈椭圆型，转化淋巴细胞体积比正常淋巴细胞体积增大，成团、悬浮生长，见图1。 　　（A）×200 （B）×400 　　Fig.1 transformed lymphocytes under the inverted microscope 　　2.2 SCID小鼠体内EB病毒诱发瘤的获得和鉴定 SCID小鼠在其胸腔、腹腔内形成肿瘤。免疫组织化学检测结果显示：白细胞共同抗原（LCA）阳性，B细胞标记（CD20，CD79a）阳性，T细胞标记（CD3，CD45RO）阴性，病理学诊断为弥漫大B细胞性淋巴瘤。 　　2.3荧光定量RT-PCR结果 LMP-1基因在转化细胞中的表达比在诱发瘤细胞的表达上调3.37倍（P0.01），LMP-2A基因在转化细胞中的表达比在诱发瘤细胞的表达上调46.74倍（P0.05）。LMP-2B基因在转化细胞中的表达比在诱发瘤细胞的表达上调262.05倍（P0.05）。 　　2.4 western blot 检测LMP-1的表达 采用western bolt方法检测LMP-1在正常细胞、诱发瘤细胞和转化淋巴细胞中的表达情况，见图2。 　　Fig.2 Expression of LMP-1 protein in three cells 　　3讨论 　　之前研究显示LMP的三个亚基能通过不同方式促进肿瘤的发生。如LMP-1能通过上调致癌潜能转录因子，干扰细胞信号转导，帮助病毒免疫逃逸等多种方式促进肿瘤的发生。LMP-2A可通过增强细胞周期诱导和凋亡抑制等相关基因的表达[3]，通过调节LMP-1的表达等方式促进细胞恶性转化。LMP-2A一方面产生B细胞受体替代物帮助EBV存活，同时阻止B细胞的激活维持EBV的持续潜伏感染。在这个过程中的作用LMP-2B通过调整LMP-2A的