【2017年整理】EMSA试验成功的关键因素.docVIP

EMSA试验成功的关键因素:1. 1.试验设计,主要是你用药品刺激细胞时,设计的药品浓度和时间剃度的问题,这个很关键,很多同学不注意这一点,最后试验确实是拿不到阳性结果,比如我一前一个朋友用药物处理SGC7901细胞,就是因为时间点设计的不好EMSA试验结果是阴性的,后来根据自己药品刺激的特性重新设计了刺激时间剃度,最终得到阳性结果! 所以这个设计很关键!!!给一个个人的实验总结希望能帮助大家:一是受体结合类的直接刺激激活信号通路的方法，一般达到EMSA核转运高峰的时间比较短，大概控制在30min-2h之间，很多时候都是在45min和1h达到高峰，当然还有合适的浓度！！！二是是你用的是药物刺激产生受体可能时间会长一些,因为药物还有一个渗透和刺激产生细胞因子的过程.时间可以长一些,主要根据自己的药物刺激特性确定时间点.2.核蛋白样品的制备;制备蛋白样品的关键是:1.注意用专用的和核蛋白抽提试剂来做,才能使制备的核蛋白保持蛋白原有的天然活性和构像.2.掌握好核蛋白的浓度和纯度,尤其是浓度. 能入核的蛋白本来就不是很多,所以核蛋白的浓度往往不会很高,但是EMSA试验对核蛋白的浓度要求还是听高的! 一般要求在1ug/ul以上!有时候稍微低于这个数量级也可以,但是不能太低,否则影响结合反应拿不到结果. 这就要求核蛋白抽提尽量避免核蛋白的损失.同时,一般制备核蛋白的材料为细胞和组织, 细胞要比组织好做的多,最重要的是用细胞得到核蛋白的纯度比组织要高很多. 而组织抽提后杂蛋白相对较多!杂蛋白多会影响试验结果不容易得到EMSA阳性结果!!3.探针的制备: 又很多站友都在问我生物素标记到3’端还是5’端,其实我觉得最好还是两端都标记,这样才能更好的提高灵敏度, 国内的标记技术我还不是很了解,我们这边的探真都是国外定做的,还算可以,其制作程序如下: 合成寡核苷酸标记生物素纯化退火合成双链.也是一个比较复杂的过程.4.EMSA实验技术. 这一点主要是操作的细节问题! 下面会更细的谈到.技术要点: 关于技术要点,我在这里只提一下关键的几点需要注意的细节操作,其他的照正常程序就可以了!1. 制胶 必须是非变性PAGE凝胶,我们实验室一般用6.5%的非变性胶.制胶很重要,直接影响电泳的效果!一般控制在5分钟凝固的效果.10X TBE 1.0ml40% Acrylamide（40%聚丙烯酰胺） 3.3ml50% Glycerol（50%甘油） 1.0mldH2O（蒸馏水） 14.8mlTEMED（四甲基乙二氨） 20μl脱气10min 10% AP（过硫酸氨） 120μl总量 20.0ml2. 一般试剂盒包括的试剂l 10X Binding Buffer（10X 结合反应液）(-20 oC) l Poly (dI:dC) (dI:dC)（聚核苷酸竞争物）(-20 oC) l 6X Loading Buffer（10X 上样缓冲液）(4 oC) l Cold oligonucleotides（非标记竞争性寡核苷酸）(-20 oC) l Biotin-Labeled Probe（生物素标记探针）(-20 oC) l Streptavidin-HRP（链霉亲核素-HRP）(4oC) l 2×Blocking Buffer（2× 封闭液）(4 oC) l 5×Washing Buffer（5× 洗涤液）(4 oC) l Equilibration Solution（平衡液）(4 oC) l Binding-membrane（结合反应膜）(RT) 3. 结合反应每次结合反应需1-5μl核蛋白(根据核蛋白浓度而定)，根据不同的核提取物浓度加入核提取物用量，用双蒸蒸馏水将终体积调节到15μl（1） 结合反应体系：10X 结合反应液 1.5μlPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0μl细胞核提取物* ? μl双蒸水* ? μl混匀室温静置20 分钟 生物素标记的探针 0.5μl总量 15μl混匀室温静置20分钟或以上。（2）特异性反应确认竞争反应体系：10X 结合反应液 1.5μlPoly(dI:dC)(dI:dC) 1.0μl细胞核提取物 ? μl未标记的竞争性寡核 2.0μl 双蒸水* ? μl混匀室温静置20 分钟 生物素标记的探针 0.5μl总量 15μl混匀室温静置20分钟或以上。其中:探针用量: 这相当于10-50fmoles的DNA探针。我们通常是最少50fmol.蛋白样品用量: 一般用量在220ug(控制在1-5μl)蛋白, 总体系15ul. 细胞核抽屉物浓度都比较低,组织的一般都比较高,因为杂蛋白较多.poly(dI:dC)(dI:dC