【2017年整理】DotBlot检测流程.docVIP

第九章 免疫学活性测定 Dot blot 原理： 原理：抗原抗体和受体配体结合可以被利用作蛋白质简单快速的定量分析。被吸附在96孔板底部的抗原抗体或者受体配体可以被标记的抗体识别并进行定量记数形成定量分析方法的基础。由于细胞培养需要不断监测，工作量很大。因此快速简洁的定量分析是检测细胞表达水平监测的重要手段。主要监测方法包括Dot blot 和ELISA。 Dot blot Dot blot是最快速简捷的方法，简述如下：在超净台内，使用无菌多孔加样器将96孔板内的细胞克隆培养液以5上样量，成排点于硝酸纤维素膜上并风干，记录好样品顺序（可在膜的正面边缘处标记正面及名称，也可通过在膜的右下角剪去一角作为标记，识别膜的正反面及方向）。取上面风干好的硝酸纤维素膜，用配制好的封闭液（脱脂奶粉或白蛋白溶液）室温震荡孵育至少一小时。此步骤的目的是封闭硝酸纤维膜上的非特异性蛋白结合位点，以避免下一步加入的抗体与膜发生非特异性结合。将封闭好的硝酸纤维膜浸泡在第一抗体中，室温震荡孵育1小时，然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后，将膜浸泡到TTBS溶液中，室温震荡洗涤3次，每次5分钟。将洗涤后的硝酸纤维膜浸泡在含有酶标第二抗体溶液中，室温震荡孵育1小时，然后用TTBS溶液淋洗膜2遍后，将膜浸泡到TBST溶液中，室温震荡洗涤3次，每次5分钟。最后，将膜浸于荧光显色剂（新鲜刚刚混合的等量A和B液）。1-2分钟后将浸泡过的膜，抖去多余显色剂，夹入保鲜膜（保鲜膜应薄而透明，以免阻挡曝光效果）中，同时观察显色情况，确定大致曝光时间（一般情况下，如果样品亮度肉眼可见且较强，那么初次曝光时间应较短，一般选3-5秒；如果样品亮度肉眼不可见，则初次曝光时间应略长一些，一般选择1分钟）经显影，定影后用清水冲洗X光胶片，根据胶片上结果情况，再将膜放入曝光暗盒中进行二次曝光及显影、定影反应。溶液配制及整个操作过程请斑点杂交操作流程图。Dot blot需要TTBS溶解的倍比稀释后的标准品做对照方能进行半定量。同时样品倍比稀释也是半定量所必需。 附1：Dot-Blot操作流程图  ELISA 1、双抗体夹心法：本法适用于样品含量低灵敏度要求高的定量分析，简述如下。先用选定的第一抗体（单抗原结合点的单抗为首选）在碱性条件下（一般PH=8.0～8.5碳酸盐缓冲液）包裹96孔板，置4℃过夜或者室温1小时。然后用排枪或真空吸管吸出一抗，再用BSA或稀释的奶粉封闭45至60分钟。封闭后用洗涤液洗板2次。加入待测抗原样品（条件培养液）和标准品(PBS稀释)。用洗涤液洗板2次。加入标记好的相应抗体室温1小时。用洗涤液洗板2次。如果不是标记的抗体，可再用标记的抗一抗抗体(二抗)重复以上步骤再加入底物液显色和上机读数。  2、间接法：适用于灵敏度要求低，样品含量高的分析方法，步骤如下。将制备好的标准品及样品，加至96孔酶标板，置4℃过夜,或室温放置3小时。用洗涤液PBS-T配制的1%BSA溶液加至板内， 37℃放置1小时。将封闭好的酶标板用洗涤液洗板2次。将一抗加至板内，同时加入两孔空白对照(稀释液)， 37℃放置1小时。用稀释液稀释HRP酶标记的第二抗体加至板内，37℃放置1小时。用洗涤液洗板2次。加入底物液显色和上机读数。注：终止液可加可不加。 3、结合竞争法：放射免疫法是典型的竞争法。它利用同位素标记抗原（I-125）与非标记抗原竞争结合抗体。非标记抗原或者样品中的抗原越多标记的抗原（I-125）与抗体结合的越少。一定浓度的PEG可以沉淀抗体结合的标记的抗原（即抗原-抗体复合物），但不可以沉淀游离的抗体或抗原（即非结合的抗原或者抗体）。沉淀的抗原-抗体复合物离心后吸出上清中的非结合的抗原或者抗体可以经过放射性计数定量。标准品或样品中的待测抗原越少计数越高。根据这个道理可以画出标准曲线和查出相应标准品中的抗原含量。此法灵敏度高于其它方法，可达到10-100pg/ml水平，适用于血浆和组织药物浓度的动力学研究（药物PK study）。 4、新方法的建立原则 以上所有方法的建立主要取决于抗体质量的好坏，因此多试几个商品化的抗体有必要。 一般情况下，先决定所测样本中抗原量的最低和最高限度，即测定范围。原则上要求抗原和抗体的浓度等量，比如新方法要求检测抗原浓度在1～10mg/L范围内，灵敏度要求是1mg/ml，最高浓度10 mg/ml，高于10 mg/ml使用样品倍比稀释的方法来解决。此时，检测抗原浓度在1mg/L，假设需要100%抗原抗体结合的有效抗体稀释度为1：8000，又假设需要100%抗原抗体结合的有效抗体稀释度为1：4000。 因此决定此法有效抗体稀释度在1：8000到1：4000之间。我们的结论是一般情况下抗